α-苦瓜素对巨噬细胞炎性细胞因子风暴的选择性抑制作用

目的α-苦瓜素(α-momorcharin,α-MMC)能受体依赖性靶向作用于单核细胞,调节其细胞因子表达而发挥免疫调节作用,但对巨噬细胞是否具有选择性调节作用尚不清楚。本实验通过细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的M1型炎性巨噬细胞模型,观察α-MMC对其炎性细胞因子风暴的抑制作用,并探讨其可能的靶向作用机制。方法Western blot法检测WIL2-S B淋巴细胞、H9 T淋巴细胞、THP-1单核细胞和M0巨噬细胞LRP1受体蛋白表达;CCK-8法检测4种细胞的生存率;ELISA检测M1巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平;Western blot法检测M1巨噬细胞TLR4信号通路相关蛋白的表达。结果巨噬细胞具有与单核细胞一致的高密度LRP1受体;α-MMC在4个细胞上的存活率与该受体的密度呈正相关;α-MMC以剂量和时间依赖性抑制M1巨噬细胞的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1α和MCP-1表达;α-MMC对TLR4信号通路的TAK1/p-TAK1、p-JNK、p-AP1和p-p65信号蛋白有明显的抑制作用,这种抑制作用能被LRP1受体阻断剂阻断。结论α-MMC通过LRP1受体介导,抑制TLR4信号通路的TAK1,进而抑制下游NF-κB和MAPK通路,从而选择性抑制巨噬细胞炎性细胞因子表达。α-MMC对巨噬细胞的选择性免疫抑制作用可能使其成为治疗急性感染巨噬细胞激活综合征(macrophage activation syndrome,MAS)的非常有前途的药物。

苦瓜α-苦瓜素基因启动子克隆与单倍型分析

为探明α-苦瓜素基因的表达调控规律,从苦瓜种质Y5中克隆了α-苦瓜素基因上游包括起始密码子在内的1 620 bp序列,选取转录起始位点上游1 500 bp序列,利用Plant CARE在线启动子预测工具进行分析。结果表明,α-苦瓜素启动子除了含有TATA-box和CAAT-box等核心元件外,还含有光响应元件、赤霉素响应元件、热胁迫响应元件、干旱应答元件、水杨酸应答元件、茉莉酸应答元件等。以28份苦瓜种质为材料,分析了α-苦瓜素启动子区域SNP和In Del分布情况,共发现24个SNP位点和1个In Del,28份苦瓜种质资源共存在4种单倍型。3个SNP位于转录因子结合位点,可能对α-苦瓜素基因的表达调控有重要作用。

苦瓜籽蛋白的分离纯化及免疫原性分析

经过NaCl溶液匀浆抽提、硫酸铵分级分离、SP-SepharoseFastFlow层析、SephacrylS-100层析、Macro-Cap-SP层析,从苦瓜籽中同时分离纯化出大量的α-苦瓜素和苦瓜抗HIV蛋白30。经SDS-PAGE鉴定,二者均为单一条带,表观分子量为28kDa。用两种蛋白分别免疫Balb/c小鼠,双向免疫扩散表明,两种苦瓜籽蛋白无交叉反应。本实验为进一步探索PEG修饰MAP30免疫原性变化打下了基础。

苦瓜蛋白的药用价值

苦瓜为葫芦科苦瓜属植物,从中提取的蛋白质成分包括蛋白酶抑制剂、核糖核酸酶、核糖体失活蛋白等,具有比较广泛的药理学作用。MAP30等可以通过使核糖体失活,抑制肿瘤细胞蛋白质的合成,抑制肿瘤细胞的生长;通过抑制T细胞的增长,抑制HIV病毒的复制,达到治疗艾滋病的目的。笔者着重对其抗肿瘤作用及抗艾滋病作用进行了综述,认为苦瓜蛋白成分的开发和应用给恶性肿瘤和艾滋病的治疗提供了新的思路,具有潜在的开发应用前景。

苦瓜子蛋白的分离纯化及其性质研究

从苦瓜种子的粗提物苦瓜子蛋白丙酮分级沉淀干粉中,用CM-Sephadex C-50和SephadexG-75分离得到了两个核糖体失活蛋白,α-苦瓜子蛋白(α-momorcharin,α-MMC)和β-苦瓜子蛋白(β-momorcharin,β-MMC),其等电点分别为9.10(α-MMC),9.32(β-MMC).用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定它们的分子量,分别为28625(α-MMC),29076(β-MMC)(+Na,29099);,28795(α-MMC),29074.7(β-MMC).它们都是糖蛋白.其生物活性的分析测定表明,都属于RNA N-糖苷酶.本文重点对β-苦瓜子蛋白的分离纯化及其性质进行详细报道,并对其N-端部分的氨基酸顺序进行了测定.

丝瓜和苦瓜核糖体失活蛋白的比较研究

从丝瓜和苦瓜种子中分离得到的丝瓜子和苦瓜子蛋白 ,均是含糖的单链核糖体失活蛋白 ,等电点在 9～ 10之间 ,在抑制蛋白质合成中丝瓜子蛋白的毒性高 ,而在抗生育活性中 ,苦瓜子蛋白较好 .

苦瓜α-苦瓜素基因克隆与单倍型分析

为了揭示苦瓜α-苦瓜素基因的完整结构及单倍型,本研究以35份苦瓜初级核心种质为材料,克隆α-苦瓜素基因,结果显示,α-苦瓜素基因全长993 bp,包括60 bp的5'-UTR,72 bp的3'-UTR,861 bp的ORF,无内含子序列,编码286个氨基酸,α-苦瓜素蛋白含有RIP蛋白保守结构域。系统进化分析结果表明,除苦瓜RIP P16094.2外,α-苦瓜素蛋白与胶苦瓜3MRW_A的亲缘关系最近,而与苦瓜MAP30蛋白的亲缘关系较远。通过比较35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因序列,共发现5个SNP位点,5个SNP位点均位于编码区。SNP分组发现,35份苦瓜种质资源α-苦瓜素基因共存在5种单倍型。5种单倍型编码的氨基酸序列比对显示,共存在1个氨基酸变异位点,氨基酸变异位点对应于第5个SNP位点,第1、第2、第3、第4 SNP位点并未引起氨基酸的改变。该结果为进一步研究α-苦瓜素基因表达调控机制和不同单倍型编码蛋白功能差异奠定了基础。

β-苦瓜蛋白质分子结构模建研究

使用DNAMAN软件分析β-苦瓜蛋白质氨基酸组成,亲水、疏水性,用生物信息学在线网站预测其基本特性,二、三级结构,卷曲螺旋区域,PEST序列,并用生物信息学软件分析其表面电位、可及性,建立Ramachandran图对模建结果进行结构质量分析与检测评价.结果发现:β-苦瓜蛋白质有249个氨基酸,等电点9.19,亲水区域和疏水区域交错分布;消光系数为280 nm,属于稳定蛋白质,平均亲水性是-0.138;二级结构中α-螺旋占42.57%,延伸链占20.48%,不规则卷曲占36.95%;分布着3段卷曲螺旋区域,存在5段非PEST序列,无稳定二聚体、三聚体卷曲螺旋;β-苦瓜蛋白质的三级结构、表面电位和可及性的空间分布得到了模建,Ramachandran图检测表明此模型结构符合立体化学规则.

α-苦瓜素基因的克隆和原核表达

α-苦瓜素(Alpha-momorcharin)是一种多功能核糖体失活蛋白,具有抗肿瘤、抗HIV-1和抗菌活性,并同时具有免疫抑制活性。利用PCR(polymerase chain reaction)技术从苦瓜基因组中扩增出了成熟的α-苦瓜素蛋白基因,并亚克隆到表达载体pET28a(+)上,然后分别在BL21(DE3)和RosettaTM(DE3)pLysS中进行表达。结果表明只在RosettaTM(DE3)pLysS中,重组α-苦瓜素基因能成功地表达出33kD大小的重组蛋白,而且在18℃和22℃的温度下,经IPTG诱导后,能成功地表达出大量可溶性重组蛋白。利用重组蛋白的N末端带有的6×His标签,通过Ni-NTA柱纯化获得了α-苦瓜素重组蛋白。Western杂交实验表明,纯化后的重组蛋白可与鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。α-苦瓜素重组蛋白的获得为进一步系统研究和改造其功能与活性奠定了基础。

α苦瓜素对大鼠长期毒性实验的血液学指标分析

目的探讨长期毒性实验中α苦瓜素(α-MMC)对大鼠的血液学影响。方法将SD大鼠随机分为生理盐水对照组、α苦瓜素各剂量组(6.25,2.08,0.70mg/kg),隔日经尾静脉注射给药一次,连续28天,停药后恢复14天,分别在给药期末和恢复期末进行血液常规检查、流式细胞分析和骨髓象检查。结果连续给予大鼠α苦瓜素28天后,随着剂量的增加,WBC、LYM、RBC、HGB逐渐减少,NEU和PLT则逐渐增多。经过14天的恢复期,各血液学指标的异常变化有所改善。结论长期给予α-MMC会引起大鼠以血细胞数量变化为主的血液学毒性变化。

苦瓜a-苦瓜素基因启动子的克隆和序列分析

以苦瓜嫩叶为试材,采用染色体步移法,克隆了α-苦瓜素基因启动子序列,并对其进行序列分析。结果表明:该启动子长1.2kb,含有2个TATA box,2个CAAT box,以及参与茉莉酸甲酯代谢、防御和压力反应、热胁迫反应、光反应调节、昼夜节律调节等的顺式作用元件。

苦瓜素性质及其生理功能研究概况

苦瓜素作为一种功能性活性物质,具有很大发展潜力。该文概述苦瓜素的分离纯化,理化性质,生理功能和作用机理。

苦瓜素类似物的分离纯化及其性质研究

本文采用硫酸铵分级沉淀、亲和层析、凝胶过滤等方法,从苦瓜(Momordicacharantia)种仁分得苦瓜素Ⅰ、Ⅱ。它们在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳上均呈现单一区带,其分子量分别为26 000和28 000,等电点8.3,含糖量1.6％和2.0％。苦瓜素Ⅰ对小鼠腹腔给药LD_(50)值为2.54mg/kg,苦瓜素Ⅱ的致死剂量范围是9-14mg/kg。它们对无细胞体系蛋白合成都有强烈的抑制活性,其IC_(50)均小于0.1ng/mL。我们将苦瓜素Ⅰ、Ⅱ与文献报道的苦瓜抑制剂(Momordica chanantiainhibitor,MCI)和α、β-momorcharin进行了比较,发现它们分别与MCI和α-momorcharin相似。由于苦瓜素Ⅱ的毒性较低,更适合于制备免疫毒素。

α－苦瓜子蛋白晶体结构中的次级相互作用的研究Ⅱ疏水相互作用的分析

α－苦瓜子蛋白结构模型中共有疏水残基１４１个，占践基总数的５７％。其中１２８个疏水残基有相互作用，占疏水残基的９１％。疏水残基之间的相互作用与其是否在α－螺旋或β片层内没有多大关系。本文着重分析了α－螺旋间和α螺旋与β结构之间的疏水相互作用；讨论了α５和大β片层中疏水残基与亲本残基的分布特点，这一特点对该蛋白分子最后折叠成特定的空间结构有重要影响。类似的情况在同源蛋白天花粉蛋白中也是存在的。

核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。

β-苦瓜素的结构分析与表位预测

采用生物信息学方法、神经网络算法、量化矩阵法和隐式马尔可夫模型,分析β-苦瓜素蛋白的空间结构,预测其信号肽、B细胞抗原表位、细胞毒性T细胞表位、主要组织相容性复合物分子结合肽,对β-苦瓜素蛋白序列作预测打分。得出β-苦瓜素启始部有一段22个氨基酸构成的信号肽,分布着6个B细胞表位,3个CTL表位,序列71-79的HLA限制性CTL表位结合力最高,3段共有MHC-Ⅰ类分子结合肽,2段共有MHC-Ⅱ类分子结合肽。可为研究β-苦瓜素调控免疫、抗癌机理提供依据。

^(125)I-α-苦瓜子蛋白的大鼠药代动力学研究

本文采用同位素示踪技术对^(125)Ⅰ-α-苦瓜子蛋白进行药代动力学研究。药物经小鼠腹腔内吸收较快,给药后2h 吸收82.3%。大鼠静脉给药后的主要药代参数T_1/2α=1.61±0.41(h),T1/2β=48.98±8.02(h),V_c=30.94±4.18(dpm/kg),K_(21)=0.084±0.032(1/h),K_(10)=0.072±0.020(1/h),K_(12)=0.23±0.08(1/h)。消除相半衰期较长,说明药物排除缓慢。药物生物利用度76.6%,提示α-苦瓜子蛋白在体内易吸收。大鼠静脉注入^(125)Ⅰ-α-苦瓜子蛋白后,血中放射性-时间数据经拟合符合二室开放动力学模型。放射性分布结果证实,最高是肾,其次为胚胎、卵巢、子宫、肝、脂肪等组织。药物主要经尿排泄,给药24h 后,排出剂量的67.3%。胆汁排泄证实此药不易形成肠肝循环。用Sephadex G-75柱层析方法证实,代谢产物仍保持原有分子大小,未被降解。

α-苦瓜籽蛋白对体外培养人胚泡滋养层和蜕膜细胞的影响

通过观察α-苦瓜籽蛋白对体外培养的人胚泡滋养层细胞形态、HCG分泌功能的影响,以及对人蜕膜细胞形态改变,探讨了α-苦瓜籽蛋白抗早孕的细胞学作用机理。0.13,0.50,2.00,8.00 μg/mlα-苦瓜籽蛋白对滋养层细胞形态有不同程度的损伤,时间越长、浓度越大则损伤越重;滋养层细胞分泌HCG功能受到明显抑制,同时对蜕膜细胞也有一定的毒性作用。实验证明:α-苦瓜籽蛋白具有直接损伤滋养层细胞以及毒害蜕膜细胞而达到抗早孕的作用。

苦瓜抗HIV活性蛋白及其聚乙二醇修饰研究进展

苦瓜籽含有许多具有抗HIV活性的核糖体失活蛋白,例如α-苦瓜素,β-苦瓜素和MAP30,它们还分别具有堕胎、抗肿瘤活性、抗乙肝病毒活性等。本文从结构、功能、抗HIV分子机制、与其它病毒作用、与其它药物相互作用等方面总结了MAP30蛋白的研究,并根据现有的聚乙二醇修饰方法对MAP30修饰研究提出了展望。

α–苦瓜素基因提高番茄对烟草花叶病毒抗性的机理研究

为了深入探究α–苦瓜素基因(αMMC)抗烟草花叶病毒(TMV)的机理,利用“番茄—TMV”互作系统,分析了αMMC转基因植株和野生型植株的生理生化参数及防御相关基因的表达。结果表明,αMMC为Ⅰ型核糖体失活蛋白,定位于细胞质;αMMC可以抑制病毒在寄主体内的繁殖,减轻番茄的病害症状,正调控番茄的防御系统。TMV侵染引起寄主体内活性氧的爆发,αMMC可以增强抗氧化酶的活性以清除活性氧,降低植物的氧化损伤,维持细胞内的氧化平衡。RT-qPCR检测结果表明,αMMC能特异性诱导防御相关基因PR1、PR4、PR6和PRB1-3的表达以提高寄主抵御TMV侵染的能力。