伊木萨克提取物调控NOD样受体蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1通路对勃起功能障碍大鼠的干预效果

目的分析伊木萨克提取物调控核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(NLRP3/Caspase-1)通路对勃起功能障碍大鼠的干预效果。方法选取40只SPF级8周龄SD大鼠,随机选取10只作为对照组,另外30只建立勃起功能障碍模型,并将30只建模成功大鼠分为3组:用生理盐水灌胃大鼠为模型组,用西地那非灌胃大鼠为药物对照组,用伊木萨克提取物灌胃大鼠为伊木萨克提取物组,每组各10只。连续灌胃28 d后,采用HE染色法观察各组大鼠阴茎海绵体病理组织学特征;比较各组大鼠性功能指标;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠外周血氮氧化物(NOX)、内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)等内皮功能指标,和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)等氧化应激指标;采用实时定量PCR法检测各组大鼠阴茎海绵体组织NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量;采用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测各组大鼠海绵体组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达情况。结果各组大鼠海绵体形态学观察显示,对照组大鼠海绵体窦状隙中具有红细胞;模型组大鼠阴茎海绵体内血窦数量、小血管数量减少,内皮细胞密度下降;药物对照组、伊木萨克提取物组大鼠阴茎海绵体内小血管数量、血窦数量增加,且伊木萨克提取物组大鼠海绵体形态学特点的改善程度大于药物对照组。与对照组比较,其他3个建模组骑跨次数、插入次数、舔嗅次数、精子密度、精子存活率均显著下降,首次爬背时间显著增加(P<0.05);伊木萨克提取物组骑跨次数、插入次数、舔嗅次数、精子密度、精子存活率显著高于模型组和药物对照组,首次爬背时间显著少于模型组和药物对照组(P<0.05)。ELISA检测结果显示,与对照组比较,其他3个建模组血清NOX、ET-1、LOX-1、MDA水平显著升高,NO、SOD、GSH水平显著降低(P<0.05);伊木萨克提取物组NOX、ET-1、LOX-1、MDA水平显著低于模型组和药物对照组,NO、SOD、GSH水平显著高于模型组和药物对照组(P<0.05)。实时定量PCR结果显示,与对照组比较,其他3个建模组NLRP3、Caspase-1相对表达量显著升高(P<0.05);伊木萨克提取物组NLRP3、Caspase-1相对表达量显著低于模型组和药物对照组(P<0.05);Western Blot检测结果显示,与对照组比较,其他3个建模组NLRP3、Caspase-1蛋白表达量显著升高(P<0.05);伊木萨克提取物组NLRP3、Caspase-1蛋白表达量显著低于模型组和药物对照组(P<0.05)。结论伊木萨克提取物可改善大鼠性功能,提高大鼠精子密度及精子存活率,其作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1通路有关。

泛素羧基端水解酶-5在妇科恶性肿瘤中的相关性研究进展

妇科肿瘤是威胁女性身体健康的主要疾病,泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)在妇科恶性肿瘤的发生发展中起着关键作用。其中,泛素羧基末端水解酶-5(UCH-L5)作为泛素羧基末端水解酶家族的主要成员,精确调控蛋白质的降解过程。其在癌基因组中的突变量远高于其他UCHs。本文综述UCH-L5的结构、功能及在妇科恶性肿瘤方面的研究进展,以期为妇科肿瘤的诊疗与机制探索提供思路。

miRNA-432-5p在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制研究

目的探讨miRNA-432-5p在脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制。方法人肺泡上皮细胞A549随机分为对照组、LPS组、miRNA-432-5p mimics组及miRNA-432-5p siRNA组。利用CCK-8实验检测细胞的活性;利用ELISA法检测细胞培养液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量;利用RT-qPCR检测细胞中miRNA-432-5p mRNA的表达;利用Hoechst染色检测细胞的凋亡情况;利用Western blot检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase1)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达。结果LPS组细胞的活性OD值(6 h:0.809±0.09;12 h:0.601±0.09;24 h:0.485±0.43)明显低于对照组的1.000±0.00,差异均具有统计学意义(P<0.05);LPS组细胞中miRNA-432-5p mRNA表达水平为1.563±0.10,明显高于对照组的1.000±0.00,细胞凋亡率为(41.52±1.83)%,明显高于对照组的(0.000±0.00)%,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,明显高于对照组的(5.27±0.84)pg/mL、(5.57±0.65)pg/mL、(3.26±0.85)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05),LPS组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,明显高于对照组的0.163±0.03、0.025±0.01、0.032±0.01,差异均具有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p mimics组细胞凋亡率为(24.23±3.09)%,明显低于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.639±0.09,明显高于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(22.85±4.01)pg/mL、(29.15±5.22)pg/mL、(20.63±3.89)pg/mL,明显低于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.473±0.04、0.121±0.02、0.279±0.04,明显低于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p siRNA组细胞凋亡率为(56.44±3.25)%,明显高于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.348±0.06,明显低于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(51.08±4.12)pg/mL、(53.61±4.83)pg/mL、(59.97±3.62)pg/mL,明显高于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.969±0.12、0.430±0.09、0.575±0.07,明显高于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-432-5p可通过抑制NLRP3炎性小体通路的激活,对受损细胞发挥保护作用。

miR-340-5p靶向调控ARID1A对甲状腺癌活性、迁移和侵袭的影响

目的 探讨miR-340-5p靶向调控富含AT的相互作用结构域(ARID)1A对甲状腺癌活性、迁移和侵袭的影响。方法 通过实时荧光定-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western印迹检测miR-340-5p和ARID1A在甲状腺癌细胞中表达水平。通过噻唑蓝(MTT)和Transwell实验检测转染miR-340-5p抑制物后癌细胞活性、迁移和侵袭变化。双荧光素酶报告基因检测miR-340-5p和ARID1A的靶向结合关系。最后通过同时敲低miR-340-5p和ARID1A的回复实验验证miR-340-5p调控ARID1A影响癌症发展。结果 miR-340-5p在甲状腺癌细胞中明显高表达,ARID1A表达明显较低(P<0.05)。通过抑制BCPAP细胞中miR-340-5p表达明显减少了癌细胞活性、迁移和侵袭水平。miR-340-5p和ARID1A具有直接靶向结合关系。敲降ARID1A能够明显逆转miR-340-5p抑制物对BCPAP细胞活性、迁移和侵袭的抑制作用。结论 miR-340-5p是甲状腺癌中的促癌基因,ARID1A为miR-340-5p的靶标下游,miR-340-5p通过靶向调控ARID1A促进甲状腺癌细胞活性、迁移和侵袭。

miR-204-5p靶向溴结构域蛋白4对舌鳞状细胞癌细胞SCC25增殖和迁移侵袭的影响研究

目的探讨miR-204-5p对溴结构域蛋白(BRD)4的靶向作用机制以及对舌鳞状细胞癌SCC25细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测舌鳞状细胞癌组织以及不同细胞株系间的miR-204-5p和BRD4 mRNA的表达水平;miR-204-5p转染SCC25细胞后,细胞计数试剂盒(CCK)8法检测其对细胞增殖的影响,Transwell小室法检测miR-204-5p对SCC25迁移和侵袭的影响;使用TargetScan和荧光素酶实验分析并验证miR-204-5p与BRD4的靶向调控关系;RT-qPCR和Western blot检测miR-204-5p模拟物和抑制剂对BRD4表达水平的影响;Transwell小室法和CCK8法检测miR-204-5p调控BRD4对SCC25增殖和迁移侵袭的影响。结果miR-204-5p在舌鳞状细胞癌组织和SCC25细胞中表达下调,BRD4在舌鳞状细胞癌组织和SCC25细胞中表达上调;提高miR-204-5p表达量抑制SCC25细胞的增殖、迁移和侵袭;TargetScan和荧光素酶实验证实miR-204-5p与BRD4具有靶向负调控关系;miR-204-5p模拟物抑制BRD4表达,miR-204-5p抑制剂促进BRD4表达上调;当在SCC25细胞中同时过表达miR-204-5p和BRD4时,BRD4能够回补miR-204-5p对SCC25细胞的抑制作用。结论miR-204-5p能够通过靶向负调控BRD4抑制舌鳞状细胞癌SCC25细胞的增殖、迁移和侵袭。

SETD5介导AKT1磷酸化调控结肠癌细胞的迁移和5-FU敏感性

目的:探讨含SET结构域蛋白5(SETD5)对结肠癌细胞增殖、迁移和对5-氟尿嘧啶(5-FU)药物敏感性的影响及机制。方法:常规培养结肠癌细胞,用Lipofectamine 2000将siSETD5-NC、si-SETD5-1~3质粒转染至HT-29细胞中,将其分为对照组(未处理)、si-SETD5-NC组、si-SETD5组和si-SETD5+SC79组,si-SETD5+SC79组HT-29细胞转染质粒的同时用10µmol/L SC79处理。qPCR法检测NCM460、HT-29和LoVo细胞中SETD5 mRNA表达,流式细胞术、细胞划痕法、WB法和CCK-8法分别检测各组HT-29细胞的凋亡情况、迁移能力、相关蛋白的表达,以及对5-FU的敏感性。结果:SETD5 mRNA在HT-29、LoVo细胞中均呈高表达(均P<0.01)。在HT-29细胞中成功地敲减了SETD5 mRNA(P<0.01)。敲减SETD5 mRNA可明显抑制HT-29细胞的增殖活性(P<0.01)、迁移能力(P<0.01)、相关蛋白(SETD5、p-PI3K、p-AKT1、p-mTOR蛋白)的表达(均P<0.01)、促进细胞凋亡(P<0.01),且提高其对5-FU的敏感性(P<0.01),这些作用均可被AKT激活剂SC79部分阻挡(P<0.05或P<0.01)。结论:SETD5在HT-29、LoVo细胞中高表达,SETD5通过PI3K/AKT1通路促进结肠癌HT-29细胞的增殖、迁移,且降低其对5-FU的敏感性,SETD5是结肠癌临床诊断、治疗的潜在靶点。

α/β水解酶结构域-6在中枢神经系统中的研究进展

α/β水解酶结构域-6(ABHD6)是近些年来被发现的一种具有丝氨酸水解酶活性的分子,在中枢神经系统中发挥重要调控作用。作为突触后内源性大麻素的主要水解酶,ABHD6参与调节神经元内源性大麻素系统(ECS);此外,ABHD6还是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)复合体的重要组成部分,可抑制AMPAR向突触后膜转位和AMPAR的兴奋性。随着不断深入的研究,ABHD6在神经炎症通路和自身免疫调节中发挥着潜在的调控效应,有望成为干预神经系统疾病的新型靶点。该文从ABHD6的分子结构与表达、中枢神经系统中的作用机制等方面,对其在神经系统疾病治疗中的最新研究进展进行综述。

降解菌JQL4-5甲氰菊酯水解酶的提取及酶学特性研究

Sphingomonas sp.JQL4-5是一株甲氰菊酯降解菌。提取该菌株的甲氰菊酯水解酶,对其酶学特性进行了初步研究。该酶水解甲氰菊酯的最适pH值为7.0,最适温度为30℃,供试的金属离子均对酶活性有一定的抑制作用,抑制率与金属离子的浓度呈正相关,其中Ag+的抑制作用最强烈,几乎可以导致酶活性完全丧失。该酶在极性有机溶剂中比在非极性的有机溶剂中稳定。

鸡MDA5的序列分析与结构域预测

为了解鸡黑色素瘤分化相关基因-5(Melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)的序列和结构域,试验使用PCR方法扩增了鸡MDA5基因并构建真核表达质粒,实现了鸡MDA5蛋白的真核表达,同时利用MegAlign等软件对鸡MDA5氨基酸序列进行分析。结果显示:鸡MDA5全长3 006 bp,编码1 001个氨基酸;鸡MDA5与人、猕猴、野猪、小鼠、绿头鸭、灰雁、鸿雁、鲫鱼、草鱼的氨基酸相似性分别为62.4%、62.9%、62.7%、64.1%、86.8%、87.3%、87.4%、48.1%、46.3%;鸡MDA5与鸟类进化关系较近,与哺乳动物次之,与鱼类进化关系较远;鸡MDA5由N端两个半胱天冬酶激活招募结构域、DExD/H box RNA解旋酶结构域和C端结构域组成;鸡MDA5二级结构包含α螺旋(50.95%)、延伸链(11.19%)、β转角(3.9%)和无规则卷曲(33.97%),三级结构与人MDA5类似,在空间上呈现半闭合环状结构。研究成功鉴定了鸡MDA5基因,分析了其基因序列并预测其结构域,为深入研究鸡MDA5结构与功能及其在鸡抗病毒天然免疫应答中的作用奠定基础。

系统性红斑狼疮患者外周血多形核粒细胞磷脂酶A2、5-脂氧化酶和白三烯A4水解酶mRNA的表达

目的:探讨磷脂酶A2(cPLA2)、5-脂氧化酶(5-LO)和白三烯A4水解酶(LTA4-H)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血多形核粒细胞(PMNs)中的表达水平,及其在SLE发病机制中的作用及意义。方法:应用反转录(RT)-PCR检测28例活动期SLE患者和25名正常人PMNs中cPLA2、5-LO和LTA4-HmRNA的表达水平。结果:活动期SLE患者cPLA2、5-LO和LTA4-H的阳性表达率与正常对照组相比差异无统计学意义;但活动期SLE患者PMNs中的5-LOmRNA的平均表达水平(0.891±0.263)明显高于正常对照组(0.641±0.138),LTA4-HmRNA的平均表达水平(0.6582±0.2804)也明显高于正常对照组(0.3392±0.0751),二者差异均有显著性(P<0.01);活动期SLE组cPLA2的平均表达水平(0.630±0.268)与正常对照组(0.504±0.192)处于同一表达水平,差异无显著性。结论:活动期SLE患者外周血多形核粒细胞中5-LO和LTA4-HmRNA的表达增加,通过诱导白三烯B4(leukotrieneB4,LTB4)的产生参与SLE的发病过程。为特异性5-LO抑制剂或LTB4受体拮抗剂治疗SLE提供了理论依据。

血清miR-138-5p,SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度的相关性研究

目的探讨血清微小RNA-138-5p(miR-138-5p)、Sorbin和SH3结构域连接蛋白2(SORBS2)水平与老年冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)患者斑块稳定性及病变程度的相关性。方法取2022年7月至2024年1月于石家庄市人民医院收治的131例老年冠心病患者,根据超声结果确定血管腔内的斑块情况分为稳定组52例和不稳定组79例;根据冠状动脉造影结果进行Gensini评分,结合病变范围分为单支病变组42例,双支病变组46例和三支病变组43例。另外选取同期在本院进行体检的49例健康者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)对两组血清miR-138-5p和SORBS2水平检测,采用Pearson法和Spearman法分析血清miR-138-5p和SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度相关性。结果不稳定组血清miR-138-5p低于稳定组、对照组,且稳定组低于对照组。不稳定组血清SORBS2高于稳定组和对照组,且稳定组高于对照组(P<0.05)。Pearson法分析结果显示,老年冠心病患者血清miR-138-5p水平与SORBS2水平呈负相关(P<0.05)。高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血清miR-138-5p水平是老年冠心病患者不稳定斑块形成的保护因素,三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、血清SORBS2水平是老年冠心病患者不稳定斑块形成的危险因素(P<0.05)。与单支病变组相比,双支病变组、三支病变组患者血清miR-138-5p水平降低,其中三支病变组降低更显著(P<0.05),血清SORBS2水平、Gensini评分升高,其中三支病变组升高更多(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示,老年冠心病患者血清miR-138-5p水平与Gensini评分呈负相关,血清SORBS2水平与Gensini评分呈正相关。结论血清miR-138-5p和SORBS2水平与老年冠心病患者斑块稳定性及病变程度密切相关。

微小RNA-25-3p靶向下调甘油磷酸二酯酶磷酸结构域5基因对乳腺癌细胞顺铂耐药性的影响

目的探讨微小RNA-25-3p(miR-25-3p)靶向甘油磷酸二酯酶磷酸结构域5(GDPD5)对乳腺癌细胞顺铂耐药性的影响及分子机制。方法本研究起止时间为2018年10月至2019年6月,人乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌顺铂耐药细胞MCF-7/DDP购于中国科学院上海细胞研究所,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测正常乳腺癌细胞MCF-7和乳腺癌顺铂耐药细胞MCF-7/DDP中miR-25-3p、GDPD5和谷胱甘肽巯基转移酶π(GST-π)的表达水平。四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测过表达miR-25-3p或过表达miR-25-3p联合顺铂对MCF-7/DDP细胞的增殖抑制作用,蛋白质印迹法检测GDPD5、GST-π和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和蛋白质印迹法验证miR-25-3p和GDPD5的靶向关系。结果与MCF-7细胞相比,MCF-7/DDP细胞中miR-25-3p的表达显著下调,GDPD5和GST-π的表达显著上调。过表达miR-25-3p后,MCF-7/DDP细胞存活率显著降低[(50.36±5.04)%比(100.00±10.11)%],CyclinD1相对表达水平降低(0.40±0.05)比(1.12±0.11),GST-π表达水平降低(0.35±0.04)比(1.15±0.12);且过表达miR-25-3p可降低MCF-7/DDP细胞的顺铂耐药性。miR-25-3p可靶向负性调控GDPD5的表达。过表达GDPD5可部分逆转miR-25-3p对MCF-7/DDP细胞增殖和顺铂耐药性的影响。结论miR-25-3p通过靶向下调GDPD5抑制MCF-7/DDP细胞存活,进而降低MCF-7/DDP细胞对顺铂的耐药性。

重组腈水解酶催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸

(S)-3-氰基-5-甲基己酸是合成普瑞巴林的关键手性中间体。笔者以表达来源于Brassica rapa subsp.的重组腈水解酶工程菌Br Nit为催化剂,不对称水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸。考察反应温度、p H以及不同底物浓度和金属离子对全细胞催化IBSN水解的影响。结果表明:全细胞催化的最适温度为30℃,最适p H为8. 0,最适底物浓度为180 mmol/L。在此条件下,利用10 g/L湿菌体催化水解IBSN,反应6 h转化率可达45. 1%,产物对映体过量值(e.e.值)达到97. 9%。

miR-497-5p靶向沉默核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1促进巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出

目的观察miR-497-5p对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白1(NLRP1)靶向调控及其对细胞胆固醇流出的影响。方法生物信息学与荧光素酶报告基因验证miR-497-5p与NLRP1靶向结合。人源THP-1单核细胞经佛波酯及氧化低密度脂蛋白处理后成为泡沫细胞。使用miR-497-5p mimic和miR-497-5p inhibitor处理细胞。实时荧光定量PCR和Western blot检测NLRP1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)表达情况。酶联免疫吸附法测定细胞培养液白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18含量。液体闪烁计数仪检测泡沫细胞胆固醇流出水平。高效液相色谱法检测泡沫细胞内脂质含量。结果 miR-497-5p mimic能够显著性降低野生型NLRP1 3′UTR报告基因的荧光素酶活性。与对照组相比,miR-497-5p mimic组NLRP1、ASC、Caspase-1的mRNA及蛋白表达水平明显下调,IL-1β和IL-18分泌明显减少。miR-497-5p mimic较对照组显著促进细胞胆固醇流出,减少细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量。结论 miR-497-5p可能通过靶向调控NLRP1,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞炎症反应并促进胆固醇流出。

脂代谢相关基因ABHD5抑制肾癌细胞体外迁移及侵袭

目的:探讨透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell cancinoma,ccRcc)细胞体外迁移及侵袭过程中与α/β自水解酶结构域5(α/β-hydrolase domain-containing 5,ABHD5)的关系。方法:采用TCGA数据库分析人ccRcc组织及正常肾组织中ABHD5的表达情况。采用ABHD5过表达慢病毒转染人肾透明细胞癌细胞株786-O及Caki-1后,运用real-time PCR及Western blot技术检测ABHD5表达改变情况。采用Transwell实验、划痕实验检测此基因对细胞体外迁移及侵袭能力的影响。结果:TCGA数据库显示ccRcc组织中ABHD5表达较正常肾脏组织显著下降(P=0.000),且其下降程度在复发转移肿瘤中进一步增加(P=0.007),与患者生存呈显著负相关(P<0.001)。Transwell实验、划痕实验显示过表达ABHD5显著抑制肾癌细胞体外迁移及侵袭能力(P<0.05)。过表达ABHD5通过影响Sting信号进而影响肾癌细胞体外迁移及侵袭。结论:脂代谢相关基因ABHD5抑制ccRcc癌细胞体外迁移及侵袭能力。

MiR-223-3p通过靶向SORBS1增加结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性

目的:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线治疗药物,CRC细胞对5-FU的耐药是导致化学治疗(以下简称“化疗”)失败的主要原因,然而耐药机制仍不明确。本研究旨在探究参与CRC细胞对5-FU耐药的抑癌基因,并寻找对该基因存在调控作用的微RNA(microRNA,miRNA)。方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载CRC数据集GSE28702和GSE69657,分别分析2个数据集中对FOLFOX化疗方案应答组和无应答组患者的差异表达基因并确定目标基因;采用在线生物信息学数据库TargetScan、miRwalk和miRDB预测靶向目标基因含山梨醇和SH3结构域蛋白1(sorbin and SH3 domain containing 1,SORBS1)的miRNA。采用瞬时转染技术在CRC细胞系HCT116、SW620中分别转染siSORBS1、HA-SORBS1、miR-223-3p mimic、anti-miR-223-3p及其相应的阴性对照(siNC、HA、miR-NC、anti-miR-NC),在HCT116细胞中共转染miR-NC和HA、miR-223-3p mimic和HA、miR-223-3p mimic和HA-SORBS1、anti-miR-NC和siNC、anti-miR-223-3p和siNC、anti-miR-223-3p和siSORBS1。采用实时反转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和/或蛋白质印迹法检测细胞中SORBS1和miR-223-3p的表达水平。转染后用不同浓度的5-FU处理细胞。采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,双荧光素酶报告分析验证miR-223-3p与SORBS1的靶向关系。结果:GSE69657数据集和GSE28702数据集应答组分别有409和528个高表达基因,共有22个高表达交集基因。在22个高表达交集基因中,与CRC化疗敏感性有关的抑癌基因有3个,选择SORBS1作为目标基因进一步探索。3个在线生物信息学数据库预测的靶向SORBS1的miRNA为miR-223-3p。用5-FU(25μmol/L)处理HCT116、SW620细胞12~36 h后,2种细胞中miR-223-3p的表达水平均显著下调(均P<0.05)。转染siSORBS1或miR-223-3p mimic后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均下调,细胞活力均增加(均P<0.05);转染HA-SORBS1或antimiR-223-3p后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均上调,细胞活力均下降(均P<0.05)。双荧光素酶报告分析结果显示:共转染SORBS13'-非翻译区(untranslated region,UTR)野生型质粒和miR-223-3p mimic的细胞荧光素酶活性显著低于共转染SORBS13'-UTR野生型质粒和miR-NC的细胞(P<0.05)。与共转染miR-223-3p mimic和HA的细胞比较,共转染miR-223-3p mimic和HA-SORBS1的细胞活力明显降低(P<0.01);与共转染anti-miR-223-3p和siNC组比较,共转染anti-miR-223-3p和siSORBS1组细胞活力明显增加(P<0.05)。结论:MiR-223-3p通过靶向SORBS1基因增加CRC细胞对5-FU的耐药性,miR-223-3p有望成为临床治疗CRC的新靶点。

RGS16蛋白协同5-FU抑制宫颈癌进展的分子机制

目的研究G蛋白信号调节子(RGS)16蛋白协同5-氟尿嘧啶(FU)抑制宫颈癌细胞生长、促进凋亡的作用及其分子机制。方法构建重组质粒pCDH-RGS16并转染293T细胞,以免疫印迹技术检测细胞培养上清中RGS16蛋白表达;以CCK-8法检测宫颈癌HeLa细胞增殖能力;以流式细胞术检测HeLa细胞凋亡;以划痕实验检测HeLa细胞迁移能力;以荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3介导的凋亡信号通路。结果293T细胞可成功表达RGS16蛋白;RGS16蛋白可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并与5-FU具有协同效应;RGS16蛋白可抑制HeLa细胞迁移;RGS16蛋白提高HeLa细胞凋亡率并与5-FU具有协同促凋亡作用;RGS16蛋白促进HeLa细胞中Caspase-3介导的凋亡信号通路分子如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)表达,抑制Bcl-2分子表达;并且RGS16蛋白与5-FU联合处理HeLa细胞后,Caspase-3介导的分子表达差异更显著。结论RGS16蛋白与5-FU具有协同抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、促进凋亡的作用,并且调控Caspase-3介导的凋亡信号通路抑制宫颈癌进展。

多酶一锅法合成硫酸基供体3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)

以腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等为原料,来源于乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的ATP硫酸化酶(ATPS)和来源于产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)的APS激酶(APSK)构建的多酶催化体系可合成3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸(PAPS)。同时,在酶法合成PAPS的反应体系中引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来源的无机焦磷酸水解酶(PPase),消耗反应过程中的副产物PPi,使得反应向生成PAPS的方向进行,大幅提高多酶法合成PAPS的产率。本研究构建了重组质粒pET-28a-sumo-ATPS、pET-28a-APSK和pET-28a-PPase,并在大肠杆菌中表达了重组酶,研究酶学性质和优化多酶催化反应合成PAPS的反应条件,以提高PAPS的产量水平,最终PAPS的累积量为14.47 g/L。该工艺可大幅降低PAPS的制备成本。

抽提透刺针法针刺联合西药治疗对脑梗死患者功能康复及血清GDF-15、Fibulin-5、UCH-L1表达的影响

目的探讨抽提透刺针法针刺联合西药治疗对脑梗死患者功能康复及血清生长分化因子-15(Growth differentiation factor-15,GDF-15)、衰老关键蛋白抗原-5(Aging key protein antigen-5,Fibulin-5)、泛素羧基末端水解酶-1(Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase-1,UCH-L1)表达的影响。方法选取东莞市中医院2019年6月至2020年12月脑梗死患者98例,采用随机数字表法分为研究组与对照组,各49例。对照组常规基础上采取西药治疗(包括氯吡格雷、神经节苷脂、阿托伐他汀治疗),研究组在对照组治疗基础上采取抽提透刺针法针刺治疗。比较两组治疗前后神经功能[美国国立卫生研究院卒中量表(National institutes of health stroke scale,NIHSS)评分、蒙特利尔认知评估量表(Montreal cognitive assessment,MoCA)]评分、躯体功能[Berg平衡量表(Berg balance scale,BBS)、Burke倾斜量表(Burke tilt scale,BLS)、Sheikh躯干控制量表(Sheikh torso control scale,Sheikh)评估躯体控制能力]评分、日常生活能力(Barthel index,BI)评分、生化指标(GDF-15、Fibulin-5、UCH-L1)水平。结果(1)神经功能:治疗后两组患者NIHSS、MoCA评分较治疗前降低,且研究组患者NIHSS评分低于对照组患者、MoCA评分高于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05);(2)躯体功能:治疗后两组患者BBS、BLS、Sheikh评分与治疗前比较差异均有统计学意义(P<0.05),且研究组患者BLS评分低于对照组患者,BBS评分、Sheikh评分高于对照组患者,差异均有统计学意义(P<0.05);(3)日常生活能力:治疗后两组患者BI评分较治疗前增加,且研究组患者评分高于对照组患者,差异有统计学意义(P<0.05);(4)生化指标:治疗后研究组患者血清GDF-15、UCH-L1水平低于对照组患者,Fibulin-5水平高于对照组患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论采取抽提透刺针法针刺辅助常规西医治疗脑梗死可取得良好效果,利于改善患者神经功能及躯体功能,可能与有效调节GDF-15、Fibulin-5、UCH-L1含量有一定关联性,值得推广。

基于核苷酸结合的寡聚结构域1/受体相互作用蛋白2通路探讨N-乙酰-5-羟色胺调控大鼠视网膜缺血再灌注后小胶质细胞极化的机制

目的观察N-乙酰-5-羟色胺(NAS)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)后视网膜小胶质细胞极化的影响,并基于核苷酸结合的寡聚结构域1(NOD1)/受体相互作用蛋白2(Rip2)通路初步探讨其机制。方法采用随机数字表法将60只雄性Sprague Dawley大鼠分为假手术组(Sham组)、RIRI组、NAS组,分别为21、21、18只,以右眼为实验眼。RIRI组、NAS组大鼠采用前房高眼压法建立RIRI模型。NAS组大鼠分别于建模前及建模后30 min腹腔注射10 mg/kg NAS。建模后24 h,苏木素-伊红、免疫组织化学染色观察各组大鼠视网膜形态学变化,计数视网膜神经节细胞(RGC);免疫荧光染色观察NAS干预对大鼠视网膜小胶质细胞极化的影响。转录组测序筛选Sham组、RIRI组间差异基因,蛋白质免疫印迹法(Western blot)、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证。免疫组织化学染色、Western blot、RT-PCR观察NAS对大鼠视网膜组织及小胶质细胞中NOD1、Rip2蛋白、mRNA表达的影响。一般线性回归分析NAS组、RIRI组大鼠视网膜组织中NOD1+细胞数差值与M1、M2型小胶质细胞数差值的相关性。结果Sham组大鼠视网膜可见大量RGC;建模后24 h,与Sham组比较,RIRI组大鼠视网膜内层厚度显著增加、RGC数量显著减少;NAS组大鼠视网膜内层厚度显著变薄,RGC数量显著增多。与Sham组比较,RIRI组大鼠视网膜M1、M2型小胶质细胞数显著增多;与RIRI组比较,NAS组大鼠视网膜M1型小胶质细胞数显著减少,M2型小胶质细胞显著增多。三组大鼠视网膜M1、M2型小胶质细胞数比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。转录组测序结果显示,建模后24 h,视网膜NOD1、Rip2为重要差异基因;RIRI组视网膜中NOD1、Rip2 mRNA、蛋白相对表达量显著高于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RIRI组视网膜小胶质细胞中NOD1+、Rip2+细胞数及mRNA、蛋白相对表达量显著高于Sham组,NAS组亦较Sham组显著升高,但低于RIRI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RIRI组视网膜小胶质细胞中离子钙接头蛋白1(Iba-1)+/NOD1+及Iba-1+/Rip2+细胞数较Sham组显著增多,NAS组较RIRI组显著减少,但仍显著多于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,NAS组、RIRI组视网膜NOD1+、Rip2+细胞数差值与M1型小胶质细胞数差值呈正相关(r=0.851、0.895),与M2型小胶质细胞数差值呈负相关(r=-0.797、-0.819),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NAS可促进RIRI大鼠视网膜小胶质细胞M2型极化,抑制M1型极化,其机制与NOD1/Rip2通路有关。