白花丹醌对人肝星状细胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影响

目的:研究白花丹醌(plumbagin)对转化生长因子β1(TGF-β1)刺激的体外培养人肝星状细胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4)的mRNA和蛋白表达、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达的影响。方法:体外培养HSC-LX2,随机设立空白组、TGF-β1刺激的模型组、TGF-β1+plumbagin(2μmol/L、1.5μmol/L及1μmol/L)组;细胞与各药物共同孵育72 h后,采用RT-PCR检测细胞Nox4 mRNA的表达;原位装载探针法测定细胞内ROS的水平;Western blot检测细胞内Nox4和α-SMA的蛋白含量。结果:与模型组比较,白花丹醌作用72 h后,2μmol/L和1.5μmol/L plumbagin能明显降低HSC-LX2细胞Nox4 mRNA和蛋白的表达(P<0.01),下调ROS水平,降低α-SMA的蛋白表达(P<0.01)。结论:Plumbagin可能是通过下调Nox4的表达进而降低ROS生成从而发挥其抑制HSC-LX2细胞活化的作用。

血清ACTN4对宫颈癌诊断及预后评价的价值

目的探讨血清α-肌动蛋白4(ACTN4)在新发宫颈癌患者中的表达,以及对诊断宫颈癌和评估生存预后的应用价值。方法选取2016年1月至2018年1月于该院就诊且首次病理检查确诊为宫颈癌的患者80例为宫颈癌组和宫颈上皮内瘤变(CIN)患者50例为CIN组,另选择同期入院进行体检的体检健康者60例为对照组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血清ACTN4水平;采用受试者工作特征曲线分析ACTN4诊断宫颈癌的效能;采用Kaplan-Meier生存曲线表示累积生存率;采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型筛选总生存期(OS)的独立危险因素。结果宫颈癌组血清ACTN4水平明显高于CIN组和对照组(P<0.05),CIN组和对照组ACTN4水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。血清ACTN4诊断宫颈癌的曲线下面积为0.856,灵敏度和特异度分别为85.6%和77.9%。宫颈癌患者国际妇产科联盟(FIGO)分期≥Ⅱb期比Ⅰa~<Ⅱb期、淋巴结转移阳性比阴性、宫颈浸润深度≥2/3比<2/3的ACTN4高表达率高,差异有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线结果显示,ACTN4高表达患者的累积生存率明显低于ACTN4低表达患者(P<0.05)。单因素和多因素Cox回归分析结果显示,FIGO分期≥Ⅱb期、淋巴结转移阳性、宫颈浸润深度≥2/3和ACTN4高表达均是影响OS的独立危险因素(P<0.05)。结论宫颈癌患者血清ACTN4高表达可能参与了疾病的发生和发展过程,有望成为疾病诊断和判断疾病预后的重要生物标志物。

铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化

背景:病理性瘢痕主要表现为异常的细胞外基质积累和过度的成纤维细胞增殖,成纤维细胞过度增殖就会产生大量以胶原纤维为主的细胞外基质。因此深入探讨成纤维细胞纤维化在病理性瘢痕形成中的作用,将为揭示病理性瘢痕的机制和生物学治疗提供新思路。目的:探讨铁死亡诱导剂RAS合成致死分子3(RAS-selective lethal small molecule 3,RSL3)对人病理性瘢痕成纤维细胞纤维化的影响。方法:收集10例宁夏医科大学总医院烧伤整形美容科提供的病理性瘢痕组织和同一个体正常皮肤组织,提取人病理性瘢痕成纤维细胞和人正常皮肤成纤维细胞用于后续实验;苏木精-伊红染色观察病理性瘢痕组织和正常皮肤组织的形态;倒置显微镜观察病理性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞的外观形态;免疫荧光实验验证所提取的细胞是否为成纤维细胞;用不同浓度的RSL3(1,3,5,7,9,11,13μmol/L)干预细胞,CCK-8法检测RSL3作用于成纤维细胞的半数抑制浓度(IC_(50));设置对照组(不做处理)和RSL3干预组(用7μmol/L的RSL3干预细胞24 h),qRT-PCR和Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白的mRNA和蛋白的表达;检测细胞丙二醛浓度;划痕试验检测细胞划痕后24 h剩余划痕面积,并计算剩余划痕面积百分比。结果与结论:①与正常皮肤组相比,病理性瘢痕组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=3.252,P<0.01;蛋白:t=5.075,P<0.01);②与正常皮肤成纤维细胞组相比,病理性瘢痕成纤维细胞组的谷胱甘肽过氧化物酶4高表达(mRNA:t=10.32,P<0.01;蛋白:t=26.22,P<0.01);③与对照组相比,RSL3干预组谷胱甘肽过氧化物酶4表达减少(mRNA:t=2.798,P<0.05;蛋白:t=4.643,P<0.01),丙二醛浓度上升(t=2.917,P<0.05),Ⅰ型胶原蛋白(mRNA:t=15.84,P<0.01;蛋白:t=4.610,P<0.01)、Ⅲ型胶原蛋白(mRNA:t=28.86,P<0.01;蛋白:t=7.713,P<0.01)和α-平滑肌肌动蛋白(mRNA:t=2.671,P<0.05;蛋白:t=7.417,P<0.01)的表达减少,迁移能力减弱(t=14.06,P<0.01);④提示RSL3通过抑制谷胱甘肽过氧化物酶4的表达,进而抑制病理性瘢痕成纤维细胞的纤维化和迁移能力。

高糖环境对小鼠足细胞骨架结构及相关蛋白的影响

目的探讨高糖培养环境对小鼠足细胞骨架结构及相关蛋白表达及分布的影响。方法体外培养和分化小鼠足细胞,分为正常对照组、高渗对照组和高糖组。免疫荧光法观察足细胞内肌动蛋白纤维骨架(F-actin)、黏着斑蛋白(vinculin)及α-actinin-4的表达及分布。Western blotting半定量检测各组足细胞α-actinin-4和vinculin蛋白的表达。结果正常对照组和高渗对照组足细胞内F-actin以张力纤维丝的形式存在,α-actinin-4主要分布在细胞周边、肌动蛋白微丝以及细胞膜皱褶中;与正常对照组和高渗对照组比较,高糖组足细胞内F-actin形成的张力纤维显著减少,α-actinin-4分布向细胞内部集中;各组vinculin的分布无明显差异。Western blotting检测结果显示:高糖组α-actinin-4蛋白的表达显著低于正常对照组(P<0.001),各组vinculin蛋白的表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论高糖可能刺激足细胞肌动蛋白细胞骨架结构重排,引起α-actinin-4的表达和分布改变。

屏哮饮对哮喘小鼠气道重塑的影响

目的:观察屏哮饮对哮喘小鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),I型胶原蛋白,及对IL-4的影响。方法:采用免疫荧光法观察哮喘小鼠肺组织α-SMA及I型胶原蛋白的沉积,并对其进行计算机图像半定量分析。用ELISA法检测支气管肺泡灌洗液中IL-4。结果:屏哮饮组小鼠肺内细支气管壁α-SMA及I型胶原蛋白沉积较孟鲁司特钠及模型组明显减少,图像半定量分析结果与模型组及孟鲁司特钠组比较有统计学意义。屏哮饮组IL-4水平显著低于模型组,差异有统计学意义。结论:屏哮饮可以改善哮喘小鼠早期气道重塑。

小鼠胚胎心流出道近段心室化形成右心室小梁部

目的：探讨小鼠胚胎心流出道快速缩短及右心室形成机制。方法用抗α-横纹肌肌动蛋白（ SCA）、抗肌球蛋白重链（ MHC）抗体标记心肌，抗GATA-4抗体标记心肌及其前体细胞，抗α-平滑肌肌动蛋白（ SMA）抗体标记早期心肌细胞，抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体显示增殖细胞，抗人／鼠活性Caspase-3（CAS-3）抗体检测凋亡早期细胞，对胚龄9d（ E9）～E12（不同胚龄胚胎各取3～5只）小鼠胚胎心连续切片行免疫组织化学染色。结果E11时动脉囊及流出道远端心肌界退却至心包腔内，GATA-4、SCA、SMA染色示第二生心区前体细胞不断分化为心肌细胞添加在心动脉端使流出道延长。小鼠胚胎心流出道于E12缩短，缩短前及缩短过程中全长未检测到CAS-3阳性细胞。 E10～12时右心室及流出道近段心肌不断增生形成小梁并侵入邻近的流出道嵴内，流出道近端嵴逐渐小梁状心肌化改建为右心室壁；E12时近段间充质性流出道嵴内出现散在的SCA、SMA阳性心肌细胞及与流出道心肌相延续的SCA、SMA弱阳性心肌细胞流，这些结果表明近段流出道心肌小梁化、流出道嵴小梁状肌化形成了右心室小梁部。结论小鼠胚胎流出道近段心室化致右心室小梁部形成及流出道快速缩短，心肌细胞凋亡及转分化对流出道快速缩短的作用甚微。

嘌呤霉素损伤小鼠肾小球足细胞系中足细胞α-辅肌动蛋白4的表达与分布

目的观察嘌呤霉素（PAN）对足细胞α-辅肌动蛋白4（α-actin-4）mRNA表达和分布的影响，探讨α-actin-4与足细胞损伤的关系。方法将体外培养肾小球足细胞系（MPC5）随机分为实验组与对照组。实验组采用PAN刺激（剂量为50mg／L），分别于8h、24h和48h观察细胞形态，提取总RNA和细胞免疫组织化学观察α-actin-4的分布。对照组用100mL／LFBS的RPMI1640培养液培养。应用Image J图像软件处理细胞图像，计算2组随机选择的30个细胞在上述3个时间点200倍镜下的细胞相对面积，实时定量荧光聚合酶链反应（RT—PCR）和间接免疫荧光法检测α-actin-4mRNA表达和分布变化。结果对照组足细胞生长情况良好，胞体呈不规则星形，与增殖状态足细胞比较，细胞体和细胞核均显著增大，自胞体伸出树枝样突起，相邻细胞问足突相互连接。实验组细胞胞体缩小，足突回缩、消失，细胞间失去相互连接。2组间α-ctin-4mRNA各时间点表达比较，8h差异无统计学意义（P＞0．05），24h、48h差异有统计学意义（P均＜0．01），实验组在24h、48h后α-actin-4mRNA表达升高。对照组α-actin-4在胞质内呈细丝状均匀分布，在足突中呈放射状分布；8h后在实验组α-actin-4压力丝纤维变短，排列紊乱，PAN刺激24h后细胞质中α-actin-4分布明显减少，刺激48h后出现细胞质分布缺失。结论α-actin-4表达分布的异常与PAN损伤足细胞的时间呈正相关，α-actin-4是足细胞损伤机制中的一个重要分子。

足细胞相关分子在多柔比星肾病大鼠模型中mRNA的表达及意义

目的探讨。肾小球足细胞相关分子podocin、nephrin、CD2AP和α-actin-4在多柔比星肾病（ADN）大鼠模型肾皮质部的mRNA表达及意义。方法建立ADN大鼠模型，实验分为模型组（ADN组，24只）和对照组（正常大鼠组，24只），模型组经尾静脉注射多柔比星6．5mg／kg，对照组注射等量9g／L盐水，分别在1、2、4和6周各处死6只大鼠，并观察各项指标的变化：（1）24h尿蛋白定量、血浆清蛋白（Alb）和总胆固醇（TC）；（2）采用荧光定量PCR检测肾皮质部podocin、nephrin、CD2AP和α-actin-4的mRNA表达。结果模型组出现高蛋白尿，在1、2、4、6周时分别为（15．66±1．50）mg／24h、（45．98±1．45）mg／24h、（65．58±4．68）mg／24h、（82．83±8．43）mg／24h；低清蛋白血症，在1、2、4、6周时分别为（27．4±2．5）g／L、（23．6±2．9）g／L、（20．6±1．5）g／L、（6．9±2．3）g／L；高脂血症，在1、2、4、6周时分别为（2．00±0．25）mmol／L、（2．16±0．44）mmol／L、（4．02±0．81）mmol／L、（7．54±1．12）mmol／L，各时间点蛋白尿、血浆清蛋白及总胆固醇与对照组比较差异均有统计学意义（P均〈0．01）。表现为典型的肾病综合征。模型组podocin在肾皮质部的mRNA表达1周（10．56±3．62）时开始下降，2周（20．44±9．03）时明显下降，4周（2．19±0．18）后较对照组下降；模型组neph—rin的mRNA表达1周（2．41±1．10）时下降达峰值，4周（0．52±0．18）后下降；模型组CD2AP的mRNA表达1周（4．17±0．79）时无明显改变，2周（6．74±1．53）时下降，4周（6．91±1．13）时下降达峰值，6周（4．04±0．82）时无明显改变；模型组α-actin-4的mRNA表达1周（1．75±0．48）时无明显改变，2周（2．01±0．55）时下降，4周（2．24±0．81）时下降达峰值，6周（1．39±0．18）时无明显改变，与对照组比较差异均有统计学意义（P均〈0．05）。结论足细胞相关分子在ADN大鼠模型中mRNA表达异常，可能是蛋白尿发生发展的关键因素之一。