利用重组人α乳清蛋白和油酸大量快速制备高活性的HAMLET肿瘤杀伤复合物

目的可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)是一种可导致多种癌细胞死亡的强效选择性肿瘤杀伤蛋白质-脂酸复合物。为了使HAMLET应用于肿瘤的治疗并对其杀伤机制进行探讨,我们需要建立和优化简便、快速、规模化制备与纯化HAMLET的方法。方法通过构建人α乳清蛋白分泌型细胞MCF-7的cDNA文库,PCR扩增出编码人α乳清蛋白成熟肽段的全长序列,然后克隆入pET30a(+)表达载体质粒,并转化BL21(DE3)宿主大肠杆菌。经过IPTG诱导,表达细菌的裂解,蛋白体外复性,Ni-NTA亲和层析柱纯化等步骤,获得了高纯度的重组人α乳清蛋白的C端His标签融合蛋白。纯化蛋白经EDTA脱钙后,与油酸(oleic acid,OA)在加热条件下制备HAMLET复合物。同时,对HAMLET的理化特性和生物学活性进行检测。结果通过与经典方法制备的牛α乳清蛋白和OA复合物(BAMLET)进行比较,发现我们制备的HAMLET在紫外吸收光谱、疏水性质特征及肿瘤杀伤活力方面与BAMLET活性相符,并且可引起HeLa肿瘤细胞的凋亡样程序性死亡。结论本研究自主制备的HAMLET成本经济、方法简便且具有较好的规模化放大前景,为日后临床应用奠定基础。

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达(英文)

将一个398 bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin, LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子- α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪α乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35S启动子———猪α乳清蛋白基因———终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化。利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株。对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中。

改造α乳清蛋白的定点突变研究

In order to establish a possible evolutionary correlation between α lactalbumin and lysozyme,site\|directed mutagenesis on α\|lactalbumin cDNA was performed to change α\|lactalbumin into lysozyme.The gene of α\|lactalbumin was cloned into phagemid pSK +vector and the single strand template of which was prepared.Thereafter,the mutagenic oligonucleotide primers were designed and used to synthesize the mutated double strand DNA.By means of this site\|directed mutagenesis,the amimo acid residues at position His 32 and Thr 33 of bovine α\|lactalbumin cDNA were substituted with Leu and Glu,respectively.Thus,the catalytic site of lysozyme was obtained in α\|lactalbumin.Furthermore,Tyr 103 was substituted by Ala and the lysozyme substrate binding conformation was formed in α\|lactalbumin as well.The structural as well as functional relationship between α\|lactalbumin and lysozyme indicated that there existed possible evolutionary correlation between the two proteins.

具有溶菌酶的部分生物活性的α-乳清蛋白(^(32)His→Leu,^(33)Thr→Glu,^(103)Tyr→Ala)突变体

在溶菌酶催化机理以及α 乳清蛋白和溶菌酶同源比较的基础上 ,构建了含 3个突变点的α 乳清蛋白突变体 (H32L ,T33E ,Y10 3A) ,并将其克隆到具有T7启动子的表达质粒pET2 8a(+ )中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3) /pLys中获得高效表达 .存在于包涵体中的目标蛋白经变复性并通过DEAESepharoseStreamline和SephacrylS2 0 0层析柱获得纯化蛋白 .合成底物 p Nitrophenyl β D N’ ,N’’ ,N’’’ Triacetyl chitotriose [pNP (NAcGlc) 3]与突变体蛋白的反应时间曲线证明突变体蛋白获得了部分溶菌酶生物活性 ,为重组鸡蛋清溶菌酶 (HEWL)的 5 .2 6 % .利用等温滴定量热法测定突变体蛋白与五糖底物chitopentaose的平均热结合能为 71.34kJ/mol,重组HEWL为 10 5 .4 7kJ/mol.实验表明 ,通过有限的几个突变就可以使α 乳清蛋白获得溶菌酶的活性 。