α变形菌纲磁螺菌属TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种快速有效检测环境中q变形菌纲磁螺菌属细菌的方法。方法本研究以α变形菌纲磁螺菌属保守且特异的16SrRNA片段为靶序列，化学合成基因序列，制备重组质粒作为磁螺菌属检测的标准品；用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）技术，针对目的片段基因设计特异性引物和TaqMan荧光探针，进行实时荧光定量PCR检测，运用统计学方法评价该方法的特异性、敏感性及重复性。结果本实验成功构建了质粒PUC19-QC，引物、探针特异性良好，标准曲线在5．10×10^1～5．10×10^7拷贝数之间具有较好的线性关系，相关系数R2=0．999。该法最低可检测到5．10x10个DNA拷贝数，灵敏度明显高于普通PCR；重复性试验表明．荧光定量PCR检测结果Ct值波动范围较小，α值的标准差均小于0．23，表明该法重复性好，可靠性高。析因方差分析表明不同稀释度之间的ct值差异有统计学意义（F=3125．305，P〈0．001），三个批次的再现性良好，差异无统计学意义（F=0．057,P=0．945），而浓度分组与时间之间也无交叉效应（F=0．533，P=0．873）。结论本实验所建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术，能够快速有效地检测仅变形菌纲磁螺菌属细菌，且检测结果稳定，受外界条件如时间、气温等影响小。