α晶体蛋白对视网膜神经节细胞作用的初步研究

提要：目的探讨α晶体蛋白对体外培养视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）的作用。方法原代培养RGCs，Thy1．1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测，10^-7、10^-6、10^-5、10^-4g／Lα晶体蛋白加入后于1、3、12h、1、2d和3d在相差倒置显微镜下观察RGCs形态学变化；计数突起数目和轴突长度；应用免疫荧光及激光共聚焦扫描技术观察实验组α晶体蛋白在体外培养RGCs上的定位并进行荧光强度半定量分析。结果Thy1．1鉴定RGCs纯度为90％～95％，RGCs10^-4、10^-5g／L组突起数目及轴突长度显著大于对照组，以10^-4g／L组变化最显著。免疫荧光结果显示10^-4g／Lα晶体蛋白组RGCs与α晶体蛋白抗体呈阳性结合，并呈先升高后降低趋势。结论α晶体蛋白能够促进RGCs生长，最佳浓度为10^-4g／L，细胞膜上抗体结合阳性，表明α晶体蛋白可与RGCs膜结合，这在α晶体蛋白促进RGCs存活和轴突再生的反应中可能起重要作用。

分离提纯牛α晶体蛋白促大鼠RGCs生长作用的观察

目的观察分离提纯的牛α晶体蛋白(α-crystallin)对体外培养视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生长的作用。方法原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,不同浓度分离提纯的牛α晶体蛋白(10-7、10-6、10-5、10-4g/L)加入后,于3、12h、1、2d和3d在相差显微镜下观察RGCs形态学变化;计突起数目和轴突长度并与正常对照组、鼠α晶体蛋白组(10-4g/L)进行比较。结果分离提纯的牛α晶体蛋白组(10-4g/L和10-5g/L)RGCs突起数目及轴突长度显著大于正常对照组(P<0.05,P<0.01),牛α晶体蛋白10-4g/L与鼠α晶体蛋白组(10-4g/L)比较无明显区别(P>0.05)。结论分离提纯的牛α晶体蛋白(10-4g/L)能够促进RGCs生长,与鼠α晶体蛋白(10-4g/L)比较无明显区别。

结核分枝杆菌α晶体蛋白(Rv2031c)的T、B细胞抗原表位在线分析

目的预测结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白α晶体蛋白(Rv2031c)的抗原表位。方法 BLAST在线分析Rv2031c与人类蛋白的同源性;利用DNAStar软件包中的Protean模块预测其B细胞和T细胞抗原表位;RANKPEP和SYPEPITHI在线预测辅助性T(Th)细胞抗原表位;SYFPEPI、BIMAS和Net CTL方法在线预测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。结果 Rv2031c与人类蛋白同源性较低,有8个潜在的B细胞抗原表位,7个候选Th细胞抗原表位和3个候选CTL表位。结论 Rv2031c含有较多潜在的人类B细胞、Th细胞和CTL抗原表位,可作为新的结核病疫苗研发的候选靶蛋白。

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。

α晶体蛋白在视神经损伤后再生中的作用研究进展

α晶体蛋白是构成晶状体的重要结构蛋白,属于小分子热休克蛋白(sHSPs)家族,除了具有热休克蛋白(HSPs)的共性,还具有抗细胞凋亡等作用。近年来研究还发现,α晶体蛋白可与视网膜神经节细胞(RGCs)的细胞膜结合来促进RGCs的存活和轴突的再生,进而部分改善视功能,但其相关机制仍无统一的结论。本文就α晶体蛋白的基本结构与功能、α晶体蛋白在视神经损伤后对RGCs的保护作用及其机制展开综述。

α晶体蛋白促进大鼠嗅鞘细胞存活的体外研究

目的研究α晶体蛋白对离体培养的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)存活和增殖的影响,探索增强移植OECs存活和增殖的有效方法。方法取大鼠嗅球进行OECs离体培养,细胞计数检测α晶体蛋白组及对照组OECs的存活数目;Brdu掺入法及流式细胞仪检测OECs的增殖。结果 (1)培养5 dα晶体蛋白组OECs数目与对照组相比无明显差异,培养6～13 d,α晶体蛋白组OECs数目明显多于对照组(P<0.05);(2)将Brdu加入培养液中8 h后,α晶体蛋白组同视野Brdu阳性细胞数与总细胞数的百分比显著大于对照组(P<0.01);(3)α晶体蛋白组G2/M期、S期细胞数明显多于对照组(P<0.01)。结论α晶体蛋白能明显促进离体培养的OECs的存活。

嗅鞘细胞移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用

目的研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)移植与α晶体蛋白联合对大鼠视神经损伤后视功能恢复的促进作用。方法玻璃体腔α晶体蛋白注射,联合视神经损伤近端移植OECs,分为4个实验组,包括α晶体蛋白注射组、OECs移植组、α晶体蛋白注射+OECs移植组、PBS对照组。于视神经损伤并移植OECs+玻璃体腔注射药物后即刻、1周、2周、1个月、2个月、3个月,用全自动眼电生理仪进行闪烁视觉诱发电位(flash-elicited visual-evoked potential,FVEP)检测,分析比较各时间点各组P1波的振幅及潜时。结果 OECs移植组及α晶体蛋白注射+OECs移植组FVEP的P1波振幅于视神经损伤后1周[(8.49±1.19)μv,(9.33±2.54)μv]、2周[(8.85±1.92)μv,(9.43±2.41)μv]、1个月[(8.46±1.09)μv,(8.72±1.91)μv]、2个月[(8.12±1.41)μv,(8.48±1.67)μv]、3个月[(7.68±2.56)μv,(8.08±1.47)μv],均显著高于对照组(P<0.01),二者联合组P1波振幅恢复更为明显。3个实验组FVEP的P1波潜时与对照组比较,均无统计学差异。结论 OECs移植与α晶体蛋白均明显促进视神经损伤后FVEP电生理的恢复,其中,二者联合的作用最为明显。

αB晶状体蛋白在视网膜及眼外组织器官中表达及其作用机制

αB晶状体蛋白是脊椎动物晶状体的结构性蛋白,广泛表达于非晶状体组织中。αB晶状体蛋白作为热休克蛋白家族成员之一,具有分子伴侣和抗细胞凋亡等生物学功能。多种因素引起的损伤,如视网膜病变、炎症反应性疾病和神经系统疾病等都与αB晶状体蛋白存在密切关系。本文综述了αB晶状体蛋白在视网膜及眼外组织器官中表达及其作用机制的研究进展。

α-crystallin与多种细胞作用的免疫荧光观察

目的在α-crystallin(α晶体蛋白)对RGCs保护性作用研究并进行定位研究的基础上,对α-crystallin与其他细胞之间的作用相比较,以期揭示α-crystallin与RGCs作用的本质。方法原代培养大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)、大鼠巨噬细胞、大鼠心肌细胞以及传代培养的ECV细胞株、293细胞细胞株、猪视网膜色素上皮细胞(RPE)。应用免疫荧光结合激光共聚焦技术观察α-crystallin与多种细胞的作用。结果免疫荧光结合激光共聚焦发现α晶体蛋白在3种细胞中有阳性免疫沉积物出现在细胞膜上,其对照组阴性;3种细胞见实验组和对照组均有阳性免疫沉积物出现在细胞浆、细胞核中。结论α晶体蛋白不是特异性与RGCs发生作用,它是广泛存在的生物学效应物质。α晶体蛋白具有s HSP的抗应激损伤特性,对于不表达内源性α晶体蛋白的同时又是抗损伤能力较弱的RGCs,可通过增加外源性α晶体蛋白达到有效保护RGCs的目的。

重组质粒pαACP-HSP70的特异性表达研究

目的观察重组质粒pαACP-HSP70在晶状体组织和非晶状体组织中的表达情况,探讨重组质粒pαACPHSP70的特异性表达。方法以晶状体组织作为A组,肺小细胞癌细胞A549、肝癌细胞7402等非晶状体组织作为B组,采用阳离子脂质体转染法将p CMV-HSP70质粒、pαACP-HSP70质粒导入A、B组后,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。结果转染p CMV-HSP70质粒到A、B组24 h后发现,两组均有绿色荧光;另外,转染pαACP-HSP70质粒24 h后仅在A组能观察到绿色荧光。结论重组质粒pαACP-HSP70不能在非晶状体组织表达,仅能在晶状体上皮细胞表达,具有组织特异性。