新型冠状病毒非结构蛋白NSP13通过调控IκBα蛋白降解抑制NF-κB信号通路

目的研究新型冠状病毒非结构蛋白13(NSP13)调控NF-κB信号通路的作用机制。方法利用GV367-NSP13-FLAG慢病毒感染的方法制备高表达NSP13的A549细胞(A549-NSP13)和A549对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测NF-κB下游细胞因子白细胞介素6(IL-6)和趋化因子5(CCL-5)表达水平;Western印迹法检测NF-κB信号通路P65、磷酸化P65和NF-κB抑制因子α(IκBα)蛋白表达。放线菌酮10 mg·L^(-1)处理细胞0,15,30,45,90和120 min,Western印迹法检测IκBα蛋白半衰期。结果与A549对照组相比,A549-NSP13细胞检测到FLAG标签蛋白条带,且NSP13 mRNA表达显著上调(P<0.01),表明A549-NSP13细胞系构建成功。与A549对照组相比,A549-NSP13细胞IL-6 mRNA和蛋白表达水平(P<0.01)及CCL-5 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)均显著降低;磷酸化P65蛋白表达下降(P<0.01),而IκBα蛋白表达上调(P<0.01);且IκBα蛋白半衰期增加(P<0.01)。结论NSP13蛋白可通过抑制IκBα降解进而抑制NF-κB信号通路的活化并降低其下游IL-6和CCL-5等炎症相关分子产生和分泌。

Bio-oss骨粉复合HIF-1α蛋白对拔牙创骨愈合影响的实验研究

目的:研究Bio-oss骨粉复合HIF-1α蛋白对拔牙创骨愈合的影响。方法:全麻下完整拔除3只Beagle犬的双侧下颌二、四前磨牙近中根,随机选择一个牙槽窝作为空白对照组,其余即刻分别植入bio-oss骨粉、biooss复合浓度为100μg/L的HIF-1α蛋白,分别与术后6、12周取材,进行Micro-CT扫描、硬组织切片染色,观察拔牙创的骨愈合情况和组织病理学变化。结果:Micro-ct扫描显示,第6周时各组骨小梁数目、骨密度和BV/TV均有一定的差别。第12周时,bio-oss复合浓度HIF-1α组与bio-oss骨粉组、空白组差别显著(P<0.05),差别有统计学意义。硬组织切片显示第12周时,bio-oss复合HIF-1α组有良好的新骨形成。结论:Bio-oss骨粉复合HIF-1α蛋白骨修复材料可以促进拔牙创的愈合。

程序化冷冻前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎的Hba-α蛋白分布和差异表达

目的利用程序化冷冻的方法,探究冷冻前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中Hba-α蛋白的分布和差异表达的变化,为今后开发和利用新型哺乳动物源抗冻蛋白提供理论依据。方法从妊娠d5小鼠体内获取孵化囊胚;从小鼠延迟着床模型获取休眠胚胎,利用Confocal显微镜和Western Blot技术对程序化冷冻前、后的各组胚胎进行Hba-α蛋白的分布和表达检测。结果孵化囊胚和休眠胚胎在程序化冷冻前、后均有Hba-α蛋白的表达;孵化囊胚经程序化冷冻后Hba-α蛋白的表达与冷冻前相比差异无显著性(P>0.05);冷冻前休眠胚胎与程序化冷冻前后的孵化囊胚相比,Hba-α蛋白的表达量显著下调(P<0.05);冷冻后休眠胚胎Hba-α蛋白的表达量显著低于其他各组(P<0.05)。结论程序化冷冻处理对小鼠休眠胚胎Hba-α蛋白的表达影响明显大于孵化囊胚;Hba-α基因具有作为新型哺乳动物源抗冻蛋白的潜力。

低氧训练对大鼠骨骼肌缺氧诱导因子-1α蛋白和血管内皮生长因子mRNA表达的影响

目的:探讨低氧训练对大鼠骨骼肌缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白和血管内皮生长因子(VEGF)基因表达的影响。方法:选用健康雄性SD大鼠72只,随机分为9组。采用递增负荷跑台训练及低氧、超低氧两种不同程度的递增低氧刺激,在运动中和运动后给予低氧处理。应用免疫组织化学、原位杂交、计算机显微图像分析等方法,检测HIF-1α、VEGFmRNA在骨骼肌组织中的定位及含量。采用相关分析方法,分析低氧训练骨骼肌HIF-1α蛋白表达对骨骼肌VEGF转录的促进作用。结果与结论:低氧和运动训练可增加骨骼肌组织HIF-1α蛋白和VEGFmRNA含量,低氧训练骨骼肌组织HIF-1α蛋白表达的增加对VEGF基因转录具有促进作用。

电针对大鼠局灶脑缺血/再灌注时大脑皮质cPKCα蛋白表达的影响

目的 :探讨电针双侧“合谷”穴区对Wistar大鼠局灶脑缺血 /再灌注时大脑皮质cPKCα蛋白表达的影响。方法 :线栓法闭塞Wistar大鼠大脑中动脉 ,制备局灶脑缺血 /再灌注模型。运用免疫组化法检测电针大鼠双侧“合谷”穴区对局灶脑缺血 /再灌注时大脑皮质cPKCα蛋白表达的影响。结果 :假手术组部分动物大脑皮质cPKCα蛋白弱表达 ,局灶脑缺血 3hr时大脑皮质cPKCα蛋白表达增加 ,但未达显著水平 (P >0 .0 5) ,再灌注 3hr、6hr时大脑皮质cPKCα蛋白表达明显增加(P <0 .0 1 ) ,而电针可以明显减少再灌注 3hr、6hr时大脑皮质cPKCα蛋白表达 (P <0 .0 1 )。结论 :电针“合谷”穴区可下调大脑皮质cPKCα蛋白表达 ,这可能与电针抗局灶脑缺血

罗非鱼无乳链球菌α蛋白基因的克隆、鉴定及分子特性分析

本研究克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0101分离株的α蛋白基因,通过生物信息学对其序列分析结果显示:α蛋白基因的ORF由1341个碱基组成,编码一个长度为446个氨基酸的多肽,N-端具有一个保守的YSIRK信号肽序列和一个AlphaC_N超家族结构域,C-末端含有1个保守Gram_pos_anchor超家族结构域,而在中间具有2个重复的Rib结构域;比较不同来源分离株的α蛋白结构,发现主要区别在于Rib结构域重复数目的不同;同源性及系统进化树分析,发现本株菌的α蛋白与已报道的人源A909和鱼源GD201008-001α蛋白聚为一簇,同源性达100%;罗非鱼源无乳链球菌α蛋白为亲水性蛋白,存在一个跨膜区,有37个潜在的磷酸化位点和1个潜在的N-糖基化位点;二级结构分析发现存在较多的无规则卷曲,推测有12个氨基酸区域可能是B细胞抗原表位;当选择大肠杆菌为表达宿主时,该重组蛋白的溶解度高达100%,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞壁上。

产气荚膜梭菌α蛋白的高效可溶性表达与基因工程亚单位疫苗的制备

通过优化α蛋白的密码子、去除蛋白信号肽、选择亲水性与抗原性较好的序列、优化表达条件等方法,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达的产气荚膜梭菌可溶性重组α蛋白,用该蛋白免疫小鼠,再用间接ELISA方法测定血清抗体水平。结果表明:针对A型、B型、C型和D型产气荚膜梭菌的保护率分别为100%、90%、85%和90%,小鼠三免后7~14 d抗体效价达到峰值。该研究表达的α蛋白具有较好的免疫原性,可进一步用于研制预防产气荚膜梭菌的基因工程亚单位疫苗。

血浆Reg3α蛋白水平与肠道aGVHD的相关性研究

本研究探讨血浆Reg3α蛋白水平与异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后肠道急性移植物抗宿主病(GIaGVHD)的临床诊断及预后的相关性。以我院2011年12月至2012年12月行allo-HSCT的103例患者为研究对象。采集移植前9 d、0 d、移植后14 d、移植后28 d、腹泻时多个时间点抗凝外周血,对发生aGVHD的患者进一步采集治疗1周及4周后抗凝外周血,采用ELISA方法检测血浆Reg3α蛋白浓度。结果表明,103例患者中无aGVHD17例,非aGVHD腹泻27例,单纯皮肤aGVHD 10例,Ⅰ-Ⅱ度肠道aGVHD(GI-aGVHD)17例,Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD32例。GI-aGVHD患者和非aGVHD腹泻患者腹泻时血浆Reg3α蛋白水平分别为111.5(54.7-180.2)ng/ml和23.9(14.5-89.5)ng/ml(P<0.001)。Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD患者治疗4周后,治疗有效组17例与治疗无效组7例血浆Reg3α蛋白水平分别为137.2(51.7-205.4)ng/ml和679.4(122.3-896.8)ng/ml(P=0.028)。治疗无效组7例全部死于aGVHD相关的多器官功能衰竭。血浆Reg3α蛋白浓度≥87.73 ng/ml时预测Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD的鉴别效度即曲线下面积最大(AUC=0.902),其诊断Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD敏感度为81.48%,特异性为82.86%。移植后Reg3α蛋白高水平组(≥87.73 ng/ml)患者Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD发生率明显高于低水平组(<87.73 ng/ml)(P<0.001)。结论:移植后血浆Reg3α蛋白水平升高提示Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD的发生,Ⅲ-Ⅳ度GI-aGVHD患者免疫抑制治疗后血浆Reg3α蛋白水平不降低与预后不良相关,血浆Reg3α蛋白水平可作为提示GI-aGVHD的生物学标志物。

金地鼠颊囊癌变过程中IκBα蛋白表达的研究

目的 :探讨核转录因子的抑制蛋白IκBα在金地鼠颊囊鳞癌发生过程中的表达及意义。方法 :建立金地鼠颊囊癌变的动物模型。采用SABC免疫组织化学方法 ,检测在地鼠颊囊黏膜正常上皮 (n =2 2 ) ,上皮单纯增生 (n =2 0 ) ,上皮异常增生 (n =35 ) ,鳞状细胞癌 (n =2 3)中IκBα的表达变化。结果 :各阶段均有IκBα的表达 ,但表达强度不同 ,呈现一种动态变化过程。在正常颊囊黏膜组织和上皮单纯增生组织中IκBα局限表达于基底层和棘层底部细胞的胞浆中。随着上皮异常增生的出现及异常增生程度的加重 ,IκBα表达显著下降 ,较正常组和单纯增生组有显著性差异 (P <0 .0 5 )。一旦鳞癌生成后 ,IκBα表达上调 ,明显高于上皮异常增生组 (P <0 .0 1) ,甚至超过癌变前正常水平 (P <0 .0 1)。结论 :IκBα在金地鼠颊囊癌变过程中的表达异常 ,尤其是在上皮异常增生阶段的表达水平下调 ,可能是口腔黏膜上皮癌变过程中的一个早期事件 。

鼻咽癌组织中BLU/ZMYND10α蛋白的表达变化及意义

目的探讨BLU/ZMYND10α蛋白在人鼻咽癌组织中的表达及其与鼻咽癌发生发展的关系。方法选取鼻咽癌蜡块标本90例(其中24例伴癌旁正常鼻咽上皮)和正常鼻咽黏膜组织蜡块标本18例,采用组织微阵列技术结合免疫组化法检测标本中BLU/ZMYDD10α蛋白表达,分析BLU/ZMYDD10α蛋白阳性表达率与鼻咽癌患者临床病理特征的关系。结果鼻咽癌组织中BLU/ZMYDD10α蛋白阳性表达率低于癌旁正常鼻咽上皮组织、正常鼻咽上皮组织(P均<0.05),鼻咽癌组织BLU/ZMYDD10α蛋白在细胞核伴或不伴细胞质阳性表达率低于正常鼻咽上皮组织和癌旁正常鼻咽上皮组织(P均<0.05)。鼻咽癌组织中BLU/ZMYND10α蛋白表达与患者性别、肿瘤组织学分类、淋巴结转移和TNM分期无关(P均>0.05)。结论 BLU/ZMYND10α蛋白在鼻咽癌组织中呈低表达,其低表达可能促进鼻咽癌的发生。

膈下逐瘀汤加减方对气滞血瘀型输卵管炎大鼠模型TNF-α蛋白表达的影响

目的研究应用多种刺激联合输卵管注菌的方法、制造出符合中医证候特点的气滞血瘀型输卵管炎大鼠模型,观察通过膈下逐瘀加减方治疗对该模型大鼠TNF-α蛋白表达的影响。方法将48只Wistar雌性大鼠随机分为4组,每组12只,分别为正常组、模型组(气滞血瘀型输卵管炎组)、成药组(康妇炎胶囊组)、中药组(膈下逐瘀汤加减方组)。正常对照组予以普通喂养,模型组给予输卵管注菌造模,并采用多种刺激干预处理以造成气滞血瘀型输卵管炎不孕大鼠模型,并观察大鼠输卵管及外部体征变化情况。成药组与中药组:即经过康妇炎胶囊以及膈下逐瘀汤加减方治疗后,观察气滞血瘀型输卵管炎大鼠的TNF-α蛋白表达情况的不同。结果模型组出现气滞血瘀型输卵管炎的症状,输卵管与周围组织黏连,显微镜下观察输卵管形态改变、增粗、积水,炎症指标TNF-α差异比较,有统计学意义(P<0.05)。结论多种刺激联合输卵管注菌建立的气滞血瘀型输卵管炎模型,符合输卵管炎病理特点和中医气滞血瘀证候的主要辨证要点,是较为理想的气滞血瘀型输卵管炎模型。膈下逐瘀汤加减方能抑制输卵管上皮TNF-α蛋白的表达,强度优于成药组。

胰岛素对人外周血单个核细胞肿瘤坏死因子α蛋白表达及分泌的影响以及普伐他汀的干预作用

探讨胰岛素对培养的人外周血单个核细胞肿瘤坏死因子α蛋白表达及分泌的影响 ,以及普伐他汀对其的作用。健康人静脉血加入淋巴细胞分离液后离心提取人外周血单个核细胞培养 ,加入不同浓度的胰岛素、普伐他汀及甲羟戊酸孵育 4 8h ,采用Westernblot及酶联免疫吸附法等方法 ,观察人外周血单个核细胞中肿瘤坏死因子α蛋白表达水平及细胞培养上清中肿瘤坏死因子α蛋白水平。结果发现 ,胰岛素可诱导人外周血单个核细胞及其培养上清中肿瘤坏死因子α蛋白水平显著升高 ,且呈剂量依赖性 ,加入普伐他汀后可使胰岛素刺激的人外周血单个核细胞及其培养液上清中肿瘤坏死因子α蛋白水平显著下降 ,普伐他汀的这种作用可被甲羟戊酸所抑制。结果提示 。

S100A4和HIF-lα蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中的表达及相关性研究

目的探讨S100A4和HIF-lα蛋白在卵巢浆液性囊腺癌中的表达及相关临床病理特征及预后的关系.方法采用免疫组织化学法检测S100A4和HIF-1α.结果 S100A4和HIF-lα蛋白在卵巢浆液性囊腺癌组织中高表达,在卵巢浆液性囊腺瘤组和正常卵巢组中低表达或不表达.S100A4和HIF-lα蛋白表达与手术病理分期、术后复发有关系(P<0.05);HIF-lα蛋白表达与伴有淋巴结转移有密切关系(P<0.05).S100A4与HIF-lα蛋白表达呈显著正相关性P<0.05).结论 S100A4和HIF-lα的表达促进卵巢浆液性囊腺癌的发生发展,S100A4和HIF-lα间存在协同作用.

结直肠癌组织中Gα蛋白i亚基的表达及临床意义

目的研究Gα蛋白i亚基(Gαi)在结直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法 50例结直肠癌肿瘤及对应切缘正常组织标本,采用定量即时聚合酶链式反应(QRT-PCR)法检测肿瘤及切缘正常组织中Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA表达水平差异;蛋白印迹(Western blot)法以及免疫组化法对蛋白表达情况进行检测,分析与Gαi1、Gαi2、Gαi3表达情况相关的因素,并探讨其表达与病理组织分型及预后之间的相关性。结果结直肠癌组织Gαi1、Gαi2、Gαi3 mRNA及蛋白的表达均明显低于配对的切缘正常组织(P<0.05)。免疫组化检测结果显示,与配对的癌旁正常组织比较,结直肠癌组织中Gαi1、Gαi2、Gαi3表达明显下调(P<0.05)。单因素分析显示,肿瘤T分级越差(χ~2=4.919,P=0.027),TNM分期越高(χ~2=7.284,P=0.007),肿瘤分化程度越差(χ~2=6.826,P=0.033),伴淋巴结转移的病人(χ~2=4.468,P=0.035),其癌组织Gαi2的表达水平越低。结论结直肠癌组织中Gαi表达下调,其中Gαi2的表达与肿瘤T分级、TNM分期、淋巴结转移呈负相关,与肿瘤分化程度呈正相关,而与年龄、性别以及神经转移与否无关。

清肺口服液对3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纤维细胞TNF-α蛋白表达的影响

目的:探讨清肺口服液含药血清对腺病毒3I、7b感染的人胚肺成纤维细胞之肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达的影响。方法:以3I、7b型腺病毒分别攻击体外培养的人胚肺成纤维细胞,制备清肺口服液含药血清,作用于该细胞,另设正常细胞组,病毒对照组,利巴韦林组,采用ELISA法检测不同组细胞上清液中TNF-α的含量,并进行比较。结果:病毒对照组较正常细胞组之TNF-α含量明显增多,清肺口服液含药血清组可显著降低3I、7b型腺病毒攻击后细胞TNF-α的浓度。结论:清肺口服液可低腺病毒感染所致人胚肺成纤维细胞TNF-α蛋白的高表达,这可能是其抗病毒作用的机制之一。

桂枝甘草汤对心阳虚心动过缓大鼠窦房结Gsα蛋白含量的影响

目的:探讨桂枝甘草汤治疗心阳虚心动过缓的作用机制。方法:复制心阳虚心动过缓大鼠模型,生理仪检测心率,免疫印迹法测定窦房结Gsα蛋白含量。结果:桂枝甘草汤能明显提高模型大鼠的心率,提高模型大鼠窦房结Gsα蛋白含量。结论:桂枝甘草汤对窦房结Gsα蛋白含量的影响是其治疗心动过缓作用的机制之一。

原发性胃癌REG Ⅰα蛋白表达与临床病理特性的相关性研究

目的探讨原发性胃癌组织中REG Ⅰα蛋白的表达与胃癌临床、病理特性和患者生存率之间的关系。方法采用免疫组化法检测235例原发性胃癌患者组织中REG Ⅰα蛋白的表达，并分析其与胃癌临床、病理特征的相关性。结果73例患者REG Ⅰα（蛋白表达呈阳性31.1％），其中呈浸润性生长者REG Ⅰα蛋白阳性率高于呈局限性生长者（P〈0．05）；印戒细胞癌者胞质呈REG Ⅰα蛋白强表达，且阳性率明显高于非印戒细胞癌者（P〈0．05）；REG Ⅰα蛋白呈阳性的高分化腺癌患者出现淋巴结和血行转移率均高于REG Ⅰα蛋白阴性者（均P〈0．05或001）；REG Ⅰα蛋白表达呈阴性的高分化腺癌患者5年生存率显著高于表达呈阳性者（P〈0．01）。结论REG Ⅰα蛋白的表达与胃癌细胞的分化状态和细胞浸润性生长有关，并可能为评估高分化胃腺癌预后的重要指标。

RNA干扰靶向抑制PI3Kp85α蛋白对大肠癌细胞侵袭、转移的影响研究

目的分析RNA干扰靶向抑制PI3K p85α表达对大鼠大肠癌细胞的侵袭及转移的影响。方法设计1条阴性载体及4条shRNA干扰载体转染大肠癌细胞,检测shRNA干扰载体对减少PI3K p85α蛋白表达的作用。结果 shRNA/324转染组PI3K p85α蛋白表达量降低幅度最大;转染shRNA/324载体的干扰组LoVo细胞迁移能力显著减弱(P<0.05)。结论 RNA干扰靶向可有效抑制PI3K p85α表达并降低肿瘤细胞运动迁移能力。

磷酸化应激诱导蛋白1和雌激素受体-α蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达及相关性分析

目的观察分析磷酸化应激诱导蛋白1(STIP1)与雌激素受体-α(ER-α)蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达情况,分析二者与甲状腺乳头状癌发生、发展的相关性。方法选取甲状腺乳头状癌患者81例,共收集石蜡包埋乳头状癌组织81例,癌旁正常甲状腺组织15例,转移癌甲状腺组织25例,单纯桥本氏甲状腺炎(CLT)组织23例,分别为甲状腺乳头状癌组、对照组、淋巴结转移癌组、CLT组,观察各组STIP1与ER-α蛋白表达情况及相关性。结果甲状腺乳头状癌组及淋巴结转移癌组STIP1与ER-α蛋白表达阳性率均高于CLT组及对照组,组间比较差异有统计学意义(P﹤0.05);甲状腺乳头状癌组中STIP1与ER-α蛋白表达呈正相关,比较差异具有统计学意义(r=0.614,P=0.009)。结论 STIP1与ER-α蛋白在甲状腺乳头状癌中高表达,可能参与了甲状腺乳头状癌的发生、发展与转移过程,二者表达呈正相关性,表明二者可能在甲状腺癌的发展中起到一定的协同作用,参与促进甲状腺乳头状癌的淋巴结转移。

人糖皮质激素受体GR_α基因表达载体的构建和GR_α蛋白的表达

目前检测糖皮质激素受体采用的是放射配体法[1,2],存在着放射污染、实验结果不稳定、需血量大(6～7 ml)等问题,因此建立一种简便、无放射污染、需血量少、易于推广的检测方法显得很重要.而ELISA检测法基本符合以上条件.要建立ELISA检测法,首先须表达糖皮质激素受体蛋白.人糖皮质激素受体(hGR)有hGRα和hGRβ两种不同的蛋白,hGRα可与糖皮质激素结合而发挥生理作用,而hGRβ不能与糖皮质激素结合,因此无生理活性[3,4].目前hGRα蛋白的表达多采用真核细胞表达,此种表达方式虽能保持蛋白的天然空间结构而具有生理活性,但要大量制备并纯化却存在困难.本研究拟构建可诱导的hGRα基因表达载体,并大量表达hGRα蛋白,为hGRα ELISA检测法的建立奠定基础.