丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆及表达分析

以商洛紫花丹参为材料,对其转录组序列SRA020132进行Blast分析,采用PCR技术克隆得到丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因Sm2-ODD1,GenBank登录号为JN935923。Sm2-ODD1基因全长1 365bp,包含3个外显子和2个内含子;cDNA全长1 189bp,读码框951bp,编码316个氨基酸残基;预测的编码蛋白具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶中结合2-酮戊二酸和亚铁离子的"H-T-D"、"H-X"和"R-Y-S"保守基序以及"果冻状"空间结构。表达分析显示,Sm2-ODD1在丹参各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在根中表达量最高,在叶中表达量最低;该基因表达明显受到MeJA、GA3和ABA的诱导,可能参与了丹参萜类代谢下游途径。

植物中α-酮戊二酸/Fe(Ⅱ)依赖双加氧酶研究进展

酮戊二酸(2OG)/Fe(Ⅱ)依赖双加氧酶[2-oxoglutarate/Fe(Ⅱ)-dependent dioxygenases,2-ODD]广泛参与植物的多种代谢过程,是植物体内一种重要的氧化酶。它不仅对植物的生长发育具有重要意义,而且在许多药用植物活性成分的生物合成中扮演重要的角色。本文主要综述2-ODD参与的不同代谢反应,为深入研究2-ODD功能提供参考。

前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸-5-双加氧酶2对肾透明细胞癌增殖和迁移的影响

目的:探讨前胶原赖氨酸-2-酮戊二酸-5-双加氧酶2(PLOD2)的表达对肾透明细胞癌增殖与迁移的影响。方法:在Timer、GEPIA、UALCAN、OncoLnc数据库中分析PLOD2在肾癌中的差异表达、肾癌分期和预后(P<0.05)。在Caki-1细胞系中使用CRISPR/Cas9技术导入shRNA敲低PLOD2。设置组别为Caki-1细胞株对照组和稳定敲低PLOD2实验组的Caki-1细胞株(sh2、sh3、sh4)。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、平板克隆形成实验、Transwell实验观察PLOD2对肾癌的增殖和迁移的影响。应用独立样本t检验进行组间比较。结果:生信数据库发现PLOD2在多种癌症中高表达,其中包括肾透明细胞癌(P<0.05)。在敲低PLOD2后,CCK-8结果显示,PLOD2敲低后细胞增殖能力明显下降(1.52±1.05比1.09±0.11(t=1.832,P<0.05)和(1.52±1.05比1.07±0.71(t=1.944,P<0.05)和(1.52±1.05比1.04±0.66(t=2.09,P<0.05)。平板克隆形成实验结果显示,PLOD2敲低后细胞增殖能力显著下降(438.3±15.3比259.3±43(t=6.79,P<0.05)和(438.3±15.3比272.3±34.8(t=7.554,P<0.05)和(438.3±15.3比290.3±40.07(t=5.97,P<0.05)。Transwell实验显示,PLOD2敲低后细胞迁移能力显著下降(508.6±16.2比215.0±13.2(t=24.24,P<0.05)和(508.6±16.2比224.6±18.5(t=15.585,P<0.05)和(508.6±16.2比220.0±4.0(t=29.809,P<0.05)。结论:PLOD2在肾癌中表达上调,敲低PLOD2能抑制肾癌细胞增殖和迁移。

PLOD1在口腔鳞状细胞癌组织和细胞中的表达及其意义

目的:探讨前胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶1(PLOD1)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织和细胞中的表达及其对OSCC细胞生物学行为的影响,阐明PLOD1作为OSCC预后标志物的潜力。方法:采用肿瘤免疫评价资源(TIMER)数据库、基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库分析头颈部鳞状细胞癌(HNSC)组织中PLOD1 mRMA表达水平及其与HNSC患者生存期的关联。免疫组织化学法检测110例OSCC组织和64例癌旁组织中PLOD1蛋白表达情况,分析其与OSCC患者临床病理特征和预后的关系。采用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评估PLOD1在OSCC诊断中的价值。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和Western blotting法检测人正常口腔上皮HOK细胞和OSCC SCC15和CAL27细胞中PLOD1 mRNA和蛋白表达水平。利用脂质体法将小干扰RNA(siRNA)片段转染至SCC15细胞,分为si-NC组(转染阴性对照si-NC)和si-PLOD1组(转染si-PLOD1),采用CCK-8法、细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验分别检测2组细胞增殖活性、划痕愈合率和侵袭细胞数。结果:公共数据库分析,HNSC组织中PLOD1 mRNA表达水平高于癌旁组织(P<0.05);与PLOD1低表达组比较,PLOD1高表达组HNSC患者生存期较短(HR=1.41,P=0.018)。PLOD1蛋白主要表达于OSCC细胞的细胞质中,OSCC组织中PLOD1表达强度高于癌旁组织(P<0.01),并与OSCC患者T分期和TNM分期有关(P=0.021,P=0.004)。PLOD1诊断OSCC的AUC为0.811,特异度和灵敏度分别63.64%和90.63%。Kaplan-Meier生存分析,与PLOD1低表达组比较,PLOD1高表达组OSCC患者生存率降低(P<0.01);COX回归分析,PLOD1高表达是影响OSCC预后的独立危险因素(P=0.012)。OSCC细胞中PLOD1 mRNA和蛋白表达水平高于HOK细胞(P<0.05)。与si-NC组比较,si-PLOD1组细胞增殖活性和划痕愈合率降低(P<0.05),侵袭细胞数减少(P<0.01)。结论:PLOD1在OSCC组织和细胞中高表达,沉默PLOD1表达可抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭。PLOD1可能是OSCC新的治疗靶点和预后标志物。

大豆GmF6′H1基因的克隆及功能验证

以大豆品种‘黑农35号’为材料,利用同源克隆方法获得了一个依赖于Fe(Ⅱ)和2-酮戊二酸的双加氧酶基因,命名为GmF6′H1。荧光定量PCR分析显示GmF6′H1在大豆根中的表达量最高,其次是荚果、叶和茎;2,4-D处理对大豆GmF6′H1的转录水平影响很小,水杨酸和激动素的处理均显著提高了GmF6′H1基因的表达,但随着处理时间的延长表达水平稳定下降,最后接近处理前的水平。带有组氨酸标签的GmF6′H1异源表达的蛋白纯化后,以阿魏酰辅酶A为底物研究了其酶活特性,利用HPLC分析检测到GmF6′H1能够催化阿魏酰辅酶A生成东莨菪素。采用农杆菌介导法将该基因转入拟南芥Atf6′h1突变体,转基因拟南芥与Atf6′h1突变体植株外在表型没有明显的差异,而香豆素的含量分析显示,转基因株系根中香豆素的含量较拟南芥Atf6′h1突变体有所提高,与野生型拟南芥中香豆素的含量接近。

ASPH在肝脏恶性肿瘤发生发展中作用和机制研究进展

天冬氨酰-(天冬酰胺酰)β-羟化酶(ASPH)是α-酮戊二酸依赖性双加氧酶,催化天冬氨酰和天冬酰胺基残基的羟化。ASPH在肝细胞癌和肝内胆管癌中均有表达,对二者的发生和发展有作用。本文主要对ASPH的结构和功能及其作用机制的研究进展进行综述。

下调HIF-1α/PLOD2信号通路对缺氧肾透明细胞癌786-0和ACHN细胞株增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨缺氧条件下缺氧诱导因子1α(HIF-1α)影响肾透明细胞癌(ccRCC)细胞迁移、侵袭和增殖的机制。方法 体外培养人ccRCC细胞,分为正常对照组(NG组)、缺氧组(Hypoxia组,1%O2)和缺氧+HIF-1α抑制剂组(Hypoxia+PX-478组,55μmol·L-1/45μmol·L-1)。用CCK-8法检测细胞活力;用Western blot实验检测各组ccRCC细胞中HIF-1α、2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2)蛋白表达量;用细胞划痕实验检测ccRCC细胞迁移能力;用Transwell实验检测ccRCC细胞迁移、侵袭能力;用克隆形成实验检测ccRCC细胞增殖能力。结果 HIF-1α抑制剂加入后的细胞活力降低,且随着药物浓度升高而降低;与NG组相比,Hypoxia组HIF-1α、PLOD2蛋白表达量均增加(P均<0.05),与Hypoxia组相比,Hypoxia+PX-478组HIF-1α、PLOD2蛋白表达量发均降低(P均<0.05);与NG组相比,Hypoxia组ccRCC细胞786-0的迁移、侵袭和增殖能力均提高(P均<0.01),与Hypoxia组相比,Hypoxia+PX-478组细胞的迁移、侵袭和增殖能力均降低(P均<0.01)。结论 缺氧条件下,下调HIF-1α/PLOD2通路可抑制786-0和ACHN细胞的迁移、侵袭和增殖。

PLOD2在瘢痕疙瘩中的表达及意义

目的探讨人正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中原胶原赖氨酸,2-酮戊二酸5-双加氧酶2(PLOD2)的表达情况及意义。方法分别对正常皮肤、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩组织中PLOD2蛋白及mRNA表达情况采用蛋白印迹、聚合酶链式反应以及免疫组织化学图像分析法进行定量分析。结果瘢痕疙瘩组织中PLOD2在蛋白和RNA水平表达情况,与其他2种组织相比统计发现差异有统计学意义(P<0.05)。定量分析3种组织免疫组化切片图像发现瘢痕疙瘩中的PLOD2蛋白表达存在高表达。结论瘢痕疙瘩组织中PLOD2存在高表达,可能是瘢痕疙瘩的新治疗靶点。

红花类黄酮生物合成通路2-ODD基因家族鉴定与表达分析

黄烷酮3-羟化酶(F3H)、黄酮醇合成酶(FLS)和花青素合成酶(ANS)是植物2-酮戊二酸依赖性双加氧酶(2-ODD)超级家族中的成员,在植物类黄酮生物合成途径中起着重要的作用。本研究利用生物信息学的方法,从红花基因组数据库中共筛选鉴定16个类黄酮生物合成通路上的2-ODD基因,这些基因编码蛋白的长度为283(CtFLS2)~442 aa(CtANS6),分子质量为32062.05(CtFLS2)~48245.49 Da(CtANS6),其编码蛋白均为亲水性蛋白。系统进化将其分为3个亚家族,保守基序分析发现该家族成员均含有H-x-D-xn-H和R-x-S两个保守残基,对上游2000 bp区域顺式作用元件分析显示该家族基因受到光、温度等环境因素及水杨酸、茉莉酸甲酯等植物激素的调控,利用qRT-PCR技术揭示了红花类黄酮生物合成通路上的2-ODD家族基因成员在红花不同花期及叶片中的差异表达。本研究可为深入挖掘红花类黄酮生物合成途径上的2-ODD基因的功能奠定基础。

多功能氧化酶莨菪碱6β-羟化酶的研究进展

2-酮戊二酸/Fe2+依赖的双加氧酶能够实现复杂结构化合物sp3杂化C-H键的官能化反应,并且反应条件温和,对底物具有高度的区域和立体选择性。莨菪碱6β-羟化酶(hyoscyamine 6β-hydroxylase,H6H)属于此类双加氧酶,是催化合成东莨菪碱的最后两步的关键酶,能够依次实现莨菪碱的6β-羟化和6,7位的环氧化反应。本文介绍了莨菪碱6β-羟化酶催化机制、底物谱和应用进展,对该酶转化不同结构特点底物的羟化、环氧化等反应的潜在能力进行了评估,为后续对酶的设计改造和应用研究提供理论基础。

氧感知机制在乳腺癌中的研究进展及其临床应用前景

乳腺癌(breast cancer)是常见恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。乳腺癌作为一种实体肿瘤,由于微血管系统的结构和功能异常会产生缺氧区域。缺氧通常与更具侵袭性的表型、转移风险增加和肿瘤治疗的耐药性成正相关。该文从不同类型的α-酮戊二酸依赖型双加氧酶介导的乳腺癌氧感知机制以及其临床应用前景作归纳总结,以加深人们对乳腺癌氧感知机制及其作用的认识。

肺腺癌组织ALKBH2、ALKBH4表达与临床病理特征和预后的关系

目的探讨肺腺癌组织Alk B同源蛋白(ALKBH)2、ALKBH4表达与临床病理特征和预后的关系。方法本研究为前瞻性队列研究,采用非随机抽样的方法选取2018年1月至2020年1月于临沂市肿瘤医院接受肿瘤切除手术的135例肺腺癌患者为研究对象。免疫组织化学法检测患者术中采集的肺腺癌组织和癌旁组织(距离癌组织>3 cm)ALKBH2、ALKBH4表达。根据肺腺癌组织中ALKBH2、ALKBH4的表达情况将患者分为ALKBH2阳性表达组(77例)与ALKBH2阴性表达组(58例);ALKBH4阳性表达组(61例)与ALKBH4阴性表达组(74例)。分析肺腺癌组织ALKBH2、ALKBH4表达与肺腺癌患者临床病理特征(包括性别、年龄、吸烟史、肿瘤部位、基因突变情况、病理分型、胸膜脉管侵犯、气腔播散和脉管癌栓情况、手术切除范围、肿瘤长径、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况和术后有无接受化疗)的关系。肺腺癌患者出院后通过电话随访的方式每6个月随访1次,随访3年,随访截至2023年1月或患者死亡,统计3年总生存率。Kaplan-Meier法绘制生存曲线,并采用Log-rank检验比较肺腺癌组织中不同ALKBH2、ALKBH4表达情况患者的生存曲线。采用单因素和多因素Cox回归分析肺腺癌患者预后的影响因素。结果135例肺腺癌患者中男78例,女57例;年龄(60.28±7.43)岁,年龄范围27~74岁。肺腺癌组织ALKBH2、ALKBH4阳性表达率均高于癌旁组织[57.04%(77/135)比25.19%(34/135),45.19%(61/135)比19.26%(26/135),均P<0.001]。有胸膜脉管侵犯、有气腔播散、有脉管癌栓、分化程度为低分化、TNM分期为Ⅲ期、有淋巴结转移的肺腺癌患者的肺腺癌组织ALKBH2、ALKBH4阳性表达率均高于无胸膜脉管侵犯、无气腔播散、无脉管癌栓、分化程度为中高分化、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移患者(ALKBH2阳性表达率比较χ^(2)值分别为5.51、6.54、6.82、5.36、6.53和8.22,ALKBH4阳性表达率比较χ^(2)值分别为5.57、6.17、6.07、5.88、7.20和8.60,均P<0.05)。135例肺腺癌患者随访3年,失访6例,死亡62例,3年总生存率为54.07%(73/135)。Log-rank检验结果显示,ALKBH2阴性表达组患者的生存状态优于ALKBH2阳性表达组(χ^(2)=11.84,P=0.001),ALKBH4阴性表达组患者的生存状态优于ALKBH4阳性表达组(χ^(2)=10.17,P=0.001)。多因素Cox回归分析显示,病理分型为微乳头型(相比贴壁型HR=1.205,95%CI:1.054~1.376)、有胸膜脉管侵犯(HR=3.587,95%CI:1.110~11.589)、有气腔播散(HR=3.357,95%CI:1.068~10.556)、有脉管癌栓(HR=3.671,95%CI:1.171~11.511)、低分化(HR=3.714,95%CI:1.068~10.556)、TNM分期为Ⅲ期(HR=4.711,95%CI:1.165~19.047)、有淋巴结转移(HR=5.136,95%CI:1.069~24.673)、ALKBH2表达阳性(HR=4.218,95%CI:1.149~15.482)、ALKBH4表达阳性(HR=3.713,95%CI:1.055~13.071)为肺腺癌患者死亡的独立危险因素(均P<0.05)。结论肺腺癌组织ALKBH2、ALKBH4表达上调,与病理分型、胸膜脉管侵犯、气腔播散、脉管癌栓、分化程度、TNM分期、淋巴结转移和不良预后有关。

山茶属三个F3H基因的分子特性、系统进化及蛋白结构差异分析

黄烷酮3-羟化酶基因(flavanone 3-hydroxylase,F3H)在植物花青素合成途径中发挥重要作用,可作为山茶花色遗传育种的候选基因。本研究在前期从Gen Bank数据库中筛选得到白花茶树CsF3H、黄花金花茶CnF3H和红花浙江红山茶CcF3H三个基因。然而,它们的分子遗传与变异信息仍然缺乏,不利于最大正向效应基因的选择利用。本研究系统探讨了CsF3H、CnF3H和CcF3H基因的分子特征、系统进化和蛋白三维结构。结果发现CsF3H、CnF3H和CcF3H三者之间存在高度序列多样性,共含37个核苷酸和9个氨基酸差异,且与CsF3H和CnF3H相比,CcF3H序列发生了更多的变异。系统进化结果表明CsF3H、CnF3H和CcF3H蛋白与猕猴桃AcF3H具有共同祖先,但在后期进化过程中,CcF3H率先与CsF3H和CnF3H二者发生分化。序列比对和保守结构域分析发现CsF3H、CnF3H和CcF3H蛋白均含有一个保守的依赖2-酮戊二酸和二价铁离子的双加氧酶超家族特征区域,该区域内的组氨酸H^(218)和H^(276)以及天冬氨酸D220是Fe^(2+)结合位点,精氨酸R^(286)和丝氨酸S^(288)是2-酮戊二酸的重要结合位点。本研究还发现了3个茶属F3H蛋白的保守结构域中存在一个差异位点,与CsF3H和CnF3H第200位异亮氨酸I200相比,CcF3H对应氨基酸变异为缬氨酸V^(200),Web logo3.4分析揭示V200在植物F3H蛋白中更为保守。空间结构分析显示CcF3H中氨基酸V~(200的替换导致它和赖氨酸K197的分子作用力增强。本研究结果表明CcF3H是更为保守的植物F3H蛋白,缬氨酸V200可能是一个重要的功能位点。上述研究也为山茶属F3H基因提供了新的信息,为今后选择CcF3H基因作为山茶花色育种最适候选基因提供了理论支撑。

大豆GmDAO1基因的功能预测及表达分析

本研究通过在大豆基因组数据库中检索拟南芥AtDAO1在大豆中的同源基因,获得了GmDAO1基因序列。通过对GmDAO1基因编码的氨基酸序列及启动子序列进行生物信息学分析,我们发现GmDAO1基因CDS序列全长951bp,编码316个氨基酸。GmDAO1编码的蛋白为亲水性蛋白,具有1个N-糖基化位点、3个激酶磷酸化位点与1个豆蔻酰化位点。结构域分析表明GmDAO1含有双加氧酶与2OG-Fe(II)加氧酶结构域,是2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因(2-ODD)家族的成员。GmDAO1预测的启动子区域含有与激素、胁迫、光应答、生物钟调控和转录因子结合相关的顺式作用元件。系统进化分析结果表明DAO1在豆科植物进化过程中比较保守。组织特异性表达分析结果显示GmDAO1在叶片中表达量最低,在根中表达量最高。因此我们推测其可能参与生长素的代谢途径。

基于转录组测序的白鼠尾草2-ODD基因家族鉴定与表达分析

酮戊二酸(2OG)/Fe(Ⅱ)依赖双加氧酶(2-ODD)在植物初生和次生代谢过程中发挥着重要作用。本研究基于高通量测序技术平台Illumina NovaSeq 6000进行了白鼠尾草(Salvia apiana Jepson)转录组测序,对测序结果进行de novo拼接后,共获得38534个独立基因(unigenes)。将获得的独立基因进行基因功能注释,有29982个独立基因获得功能注释。通过生物信息学方法在白鼠尾草转录组数据中进行2-ODD基因家族鉴定,并对鉴定得到的基因序列进行序列特征分析,包括序列的同源性、理化特征、信号肽、跨膜结构域、亚细胞定位、二级结构和三级结构预测等,另对它们的进化关系及表达模式进行分析。结果显示,从白鼠尾草转录组中共鉴定得到39个具有完整序列结构的2-ODD家族基因,这些基因编码蛋白质的平均长度为320个氨基酸,分子质量约为36.00 kDa,多为亲水性蛋白。系统进化分析将白鼠尾草2-ODD基因分为多个亚家族,这些基因在白鼠尾草不同部位均有表达,多数基因在根中的表达量明显高于叶中的表达量。本研究可为白鼠尾草2-ODD基因的深入研究奠定基础。

基于癌症基因组图谱数据库分析胶质瘤组织中PLOD3 mRNA表达水平及其临床意义

目的 基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析2-酮戊二酸-5-双加氧酶(PLOD)3 mRNA在胶质瘤中的表达。方法 下载TCGA数据库中胶质瘤数据集,比较胶质瘤和正常组织中PLOD3 mRNA表达差异,探讨胶质瘤患者预后的危险因素及PLOD3高表达和低表达患者的生存差异,分析胶质瘤组织中PLOD3共表达基因及富集的信号通路,免疫组化法验证PLOD3在胶质瘤组织中的表达。结果 PLOD3 mRNA在胶质瘤组织中表达量升高(P<0.001)。年龄(>60岁)、WHO分级(G4)、异柠檬酸脱氢酶突变状态(野生)及PLOD3 mRNA表达(高表达)是脑胶质瘤患者预后的独立影响因素。胶质瘤PLOD3高表达组中位生存时间缩短(P<0.001)。PLOD3共表达基因主要涉及内质网、谷氨酸能突触等信号通路。20例胶质瘤组织和癌旁组织中PLOD3高表达阳性率为85%和20%,差异有统计学意义(P<0.001)。结论 PLOD3在胶质瘤中显著高表达,可通过多种信号通路促进胶质瘤的发生发展。