乙酰短杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及其表达

用PCR方法扩增乙酰短杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因(ALDC),得到0.78 kb的DNA片段,扩增片段重组到表达载体pQE-9中,在大肠杆菌中得到高效表达,酶活性可达100 U/mL发酵液.

含α-乙酰乳酸脱羧酶基因的啤酒酵母工程菌的构建

利用基因工程手段将食品级醋化醋杆菌的α -乙酰乳酸脱羧酶基因引入啤酒酵母中 ,使啤酒酵母获得编码此酶的基因并表达 ,检测到α -乙酰乳酸脱羧酶的活性 ,获得一株性能优良的啤酒酵母工程菌。经测试 ,构建的工程菌与出发菌在生理、生化、发酵特性等方面无差异 ,但发酵液中双乙酰的峰值及还原时间较出发菌降低 1/

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达及鉴定

根据已知α 乙酰乳酸脱羧酶(α acetolactatedecarboxylase,ALDC)的基因序列,用PCR法从产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)中克隆到约0.8kb的DNA片段,经DNA测序证明是ALDC基因,将该基因重组到质粒pBV220中,转化大肠杆菌,实现了高表达,获得了目的蛋白表达量约50%的转化子;表达产物经鉴定具有ALDC酶活性,为可溶性表达.为下一步应用基因工程手段对其进行改造奠定了基础.

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因在啤酒酵母工业菌株中的表达

Yeast YIp\|type expression recombinant plasmid(pCMA2\|1) was constructed. The expression of α\|acetolactate decarboxylase gene from \%Bacillus subtilis\% was controled by \%CUP1\% promoter and its own terminator. The recombinant plasmid pCMA2\|1 was introduced into the brewer’s yeast PJ3\|5. Transformants were selected using copper resistance as selected marker. The results of activity assay showed that PJ3\|5 didn’t produce α\|acetolactate decarboxylase(ALDC), where as the activity of α\|ALDC in transformants were induced by copper sulfate. The laboratory scale fermentation test confirmed that the total diacetyl concentration was reduced effectively by α\|ALDC in transformant.

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达及影响重组酶活性的因素

用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从产气肠杆菌（ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ） 中克隆出０９ｋｂ 的 Ｄ Ｎ Ａ 片段，经 Ｄ Ｎ Ａ 测序证明是α乙酰乳酸脱羧酶（αａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ，α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ） 基因。将α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ基因重组到质粒ｐ Ｂ Ｖ２２０ 后，转化大肠杆菌，经筛选获得高效表达的重组子菌株。重组α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ 基因表达量占菌体总蛋白量的２７ ％ 。酶活检测表明重组子细胞表达的α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ 活性是产气肠杆菌的１２０００ 倍。另外，粗提的重组α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ 的最适ｐ Ｈ 为６５ ～７０ ，ｐ Ｈ 稳定范围为５５ ～８０ ，适合的温度为３５ ～４５ ℃。 Ｂａ２ ＋ 、 Ｃｄ２ ＋ 、 Ｆｅ２ ＋ 、 Ｃｏ２ ＋ 、 Ｍｎ２ ＋ 、 Ｓｎ２ ＋ 可提高重组α Ａ Ｌ Ｄ Ｃ 的活性。氨基酸修饰剂可降低其活性。

产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca) α-乙酰乳酸脱羧酶基因(BudA)的克隆及生物信息学分析

以Klebsiella oxytoca(K.oxytoca)HD79为出发菌株,根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列相似的特点,利用Primer5.0设计一对引物,以K.oxytoca HD79为模板,PCR扩增,获得K.oxytoca HD79基因片段Bud A,此片段经测序显示长度为780 bp,无碱基缺失。利用生物信息学软件对该序列进行了同源性分析、氨基酸组成分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二、三级结构预测。结果表明,该片段为K.oxytoca HD79的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列。对该酶进行的生物信息学特异性分析为其构建产2,3-丁二醇的工程菌株提供一定的理论参考。

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的策略

综述了宿主细胞的表达特点 ,外源基因的来源 ,表达载体和转化方法对α -乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中稳定表达的影响 ,并在此基础上提出了相应的策略。

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆及其表达

用 PCR方法扩增产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因 (AL DC) ,得到 0 .78kb的 DNA片段 ,扩增片段重组到依赖 T4 RNA聚合酶的高效表达载体 p QE- 30中 ,在大肠杆菌中得到高效表达 ,酶活性可高达 180 U/m L发酵液 ,经稳定性测定 ,重组菌株在 37℃连续培养至 6

α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达

α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒生产中能加快啤酒成熟,有重要的应用价值。本研究将枯草芽孢杆菌启动子P43克隆到质粒pUC19-ALDC中的α-乙酰乳酸脱羧酶基因之前,得到重组质粒pUC19-P43-ALDC。重组质粒pUC19-P43-ALDC与质粒pMLK83-BN同源重组,筛选得到枯草芽孢杆菌整合质粒pMLK83-ALDC。用此整合质粒转化枯草芽孢杆菌1A751,挑选出新霉素抗性且无淀粉酶活性的重组菌株。此菌株用LB培养基在37℃、220r/min摇瓶培养过夜,测得α-乙酰乳酸脱羧酶活力为15.6U/mL,说明整合的α-乙酰乳酸脱羧酶基因能够在重组菌株中稳定传代和表达。本研究首次在枯草芽孢杆菌中用整合型的方式重组表达了α-乙酰乳酸脱羧酶,提出了一种有潜力的生产α-乙酰乳酸脱羧酶的新方法。

产气肠杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆和表达

根据已知的α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactatedecarboxylase,ALDC,EC.4.1.1.5)基因序列,利用PCR方法从产气大肠杆菌(Enterobacter aerogenes)中克隆到0.8 kb的DNA片段,经DNA序列分析表明该DNA片段为ALDC基因.将该片段插入到原核表达载体pBV220中,获得表达质粒pBVEDAD,转化大肠杆菌DH5α(Escherichia coli),经热诱导后,通过SDS-PAGE分析和酶活测定,结果表明ALDC获得了高效表达.重组细胞表达的ALDC酶活是出发菌产气肠杆菌(E.aerogenes)的1 100倍.DH5α(pBVEDAD)在无选择压力下37℃连续培养60代,在42℃下热诱导5 h未见质粒丢失.

枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的克隆和生物信息学分析

α-乙酰乳酸脱羧酶是2,3-丁二醇生物合成途径的关键酶之一,利用生物信息学方法对α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)进行分析。根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10026基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到Bacillus subtilis CICC10026基因片段alsD。对该片段进行序列测定,利用生物信息学分析软件对该序列进行同源性分析、二级结构和功能性分析及3D结构预测等。结果表明:获得的alsD片段为768 bp,未发生碱基突变,该片段为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CICC10026的α-乙酰乳酸脱羧酶基因(alsD)的基因序列。本研究结果为构建产2,3-丁二醇的工程菌株奠定了理论基础。

醋酸杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

根据已知α 乙酰乳酸脱羧酶 (α ALDC)的基因序列 ,用PCR法从醋酸杆菌 (Acetobacterracens)中克隆到约 1kb的DNA片段 ,经DNA测序证明是ALDC基因 ,将该基因重组到质粒pBV2 2 0中 ,转化大肠杆菌 ,实现了高表达 ,获得了目的蛋白表达量约 40 %的转化子 ,为下一步研究其酶活性奠定了基础。

粘质沙雷氏菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的体外表达

根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶的基因序列(slaA)设计引物,以粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)HU1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到了目标基因,全长为780 bp。将该基因分别连接到大肠杆菌表达载体pET30a和毕赤酵母表达载体pPICZαA上,构建表达质粒pET30a-slaA和pPICZα-A-slaA,并在对应的宿主中进行了表达。结果表明,大肠杆菌和毕赤酵母的表达产物的最适温度和pH均分别为40℃和7,两者在不同pH下的稳定性也相似,只不过毕赤酵母的表达产物的热稳定性要略强于大肠杆菌的表达产物。

含α-乙酰乳酸脱羧酶基因重组酿酒酵母的啤酒发酵

利用E .coli和酿酒酵母的穿梭质粒pYES2为载体 ,将地衣芽孢杆菌α 乙酰乳酸脱羧酶基因导入酿酒酵母中 ,构建了重组质粒pYEA ,实现了α 乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达 .α 乙酰乳酸脱羧酶基因在酵母菌中的表达与菌体生长有关 .pYEA质粒在无选择压力的发酵条件下 ,仅能保持一定的稳定性 ,并具有降解α 乙酰乳酸的能力 ,但丢失率比较高 .

短芽孢杆菌a-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用PCR方法扩增短芽孢杆菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因,引入原核表达载体pBV220中,得到重组质粒pALDl。pALDl中的ALDC基因在大肠杆菌中高效表达,每毫升发酵液产酶80单位以下,比原始菌株提高200余倍。SDS-PAGE蛋白质分析表明,大肠杆菌DH5α(pALDl)表达的ALDC占细胞总蛋白量的40％以上。研究了重组质粒稳定性,大肠杆菌DH5α(PALDl)和HB101(pALDl)分别在无选择压力下30℃连续培养50代以上,41℃诱导不同时间,DH5α(pALDl)在热诱导5h后,未发现质粒不稳定性,HB101(pALDl)在热诱导3h后,质粒基本稳定,但热诱导5h后,丢失质粒的细胞约占70％。

高密度培养基因工程大肠杆菌生产α-乙酰乳酸脱羧酶

在 30 0 0 L 发酵罐中 ,利用分批补料培养技术高密度培养含分泌型重组质粒 p ETGAU- 10的大肠杆菌TG1,生产α-乙酰乳酸脱羧酶。通过控制发酵条件 ,发酵液的细胞密度 (OD60 0 )可达 30 .5 ,且胞外α-乙酰乳酸脱羧酶活力最高达 890 U .ml- 1 ,达到较为理想的工业化生产的要求。

α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆及在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达

以ｐＵＣ１９质粒为载体，以Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９为受体，构建了含α一乙酰乳酸脱羧酶（α－ＡＬＤＣ）基因的地衣芽孢杆菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＳ１０１０６的基因文库，得到４８００个重组转化子中均含有４～１０ｋｂ的外源插入ＤＮＡ片段。从基因文库中筛选到６个阳性克隆，对其中１个克隆的α－乙酰乳酸脱羧酶基因片段进行亚克隆分析表明，该α－乙酰乳酸脱酶基因位于１．６ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段上。对其研究发现，α－乙酰乳酸脱酶基因在大肠杆菌中表达产生的乙酰乳酸脱羧酶在最适反应温度和ｐＨ值等与供体菌的酶活相当。利用大肠杆菌和酵母菌穿梭质粒ｐＹＥＳ２为载体，可以将α－乙酰乳酸脱羧酶基因引入酿酒酵母中，从而使重组酵母菌株具有降解啤酒发酵中生成的α－乙酰乳酸，减少双乙酰含量的能力。

高表达基因工程α-乙酰乳酸脱羧酶的研制和应用

啤酒发酵分为两个阶段:主发酵和后熟发酵.主发酵阶段绝大部分酵母代谢产生的挥发性和非挥发性风味物质已经形成,后熟发酵主要是要达到以下三个目的:一是CO2饱和;二是不溶性物质的析出和胶体稳定性的改善;三是风味的改善.目前,对第一。

朱砂叶螨β-N-乙酰己糖胺酶基因TecHEX3的克隆及在蜕皮发育中的作用

【目的】本研究旨在探明朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus几丁质降解通路中的关键酶β-N-乙酰己糖胺酶基因(TecHEX3)在螨蜕皮发育中的功能,为开发新型安全的防治害螨生物农药奠定基础。【方法】利用PCR克隆朱砂叶螨TecHEX3,并进行生物信息学分析。利用RT-qPCR检测TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段(卵、幼螨、若螨和成螨)以及饲喂蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)的若螨中的表达量。通过饲喂法进行朱砂叶螨雌成螨和若螨TecHEX3的RNAi,分析沉默效率,统计并观察朱砂叶螨若螨的死亡率和致死表型。【结果】成功克隆了朱砂叶螨TecHEX3(GenBank登录号:OR413561),其编码蛋白具有典型的20糖苷水解酶家族结构特征;系统发育树表明TecHEX3与二斑叶螨T.urticae TuHEX3的亲缘性最高且均属于β-N-乙酰己糖胺酶Ⅳ型。TecHEX3在朱砂叶螨不同发育阶段都有表达,在成螨期表达量最高;饲喂500 ng/μL的20E对TecHEX3的表达有最好的诱导效果。RNAi结果表明饲喂ds TecHEX3时朱砂叶螨若螨TecHEX3表达量较对照组(饲喂ds EGFP)显著下调81%;沉默TecHEX3导致朱砂叶螨蜕皮困难或蜕皮后形态异常,致死率达40.58%。【结论】TecHEX3参与朱砂叶螨几丁质降解过程,并在朱砂叶螨的蜕皮发育过程中发挥重要作用。

不同微生物的α-乙酰乳酸脱羧酶的生理生化特性的研究

分析测定了不同微生物的α－乙酰乳酸脱羧酶（ＡＬＤＣ）酶活力，结果表明不同来源的ＡＬＤＣ酶活力有较大差异，酶反应速度曲线存在明显差异；酶反应体系的ｐＨ对ＡＬＤＣ酶活力有明显的影响，如乳酸乳球菌的ＡＬＤＣ酶反应最适ｐＨ为６．６，而产气气杆菌的ＡＬＤＣ酶反应的最适ｐＨ为５．８；酶反应体系中加入不同浓度的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸对不同来源的ＡＬＤＣ酶活性有较明显的影响。