膜分离耦合离子交换层析制备高纯度α-乳白蛋白

以生牛乳为原料,经膜分离及喷雾干燥制得鲜乳乳清蛋白粉,结合离子交换层析制备高纯度α-乳白蛋白。结果表明:在浓缩3倍、微滤1次、洗滤2次的膜分离条件下,50 nm陶瓷膜渗透液中α-乳白蛋白占真蛋白的21.04%,高于100 nm陶瓷膜渗透液(15.84%);对50 nm陶瓷膜渗透液进行喷雾干燥,并进行离子交换层析,层析时,在10倍柱体积内,Na Cl溶液浓度由0 mol/L增至0.5 mol/L,α-乳白蛋白与β-乳球蛋白能较好地分离,得到的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白纯度分别为98.18%和97.82%。本研究结果可为工业化制备高纯度α-乳白蛋白乳基料提供技术支持。

α-乳白蛋白及其组合物对秀丽隐杆线虫睡眠的改善作用

失眠的发病率逐年升高,亟需开发具有改善睡眠功效的活性物。该研究利用秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)从α-乳白蛋白、γ-氨基丁酸、L-茶氨酸和百合提取物四种活性物中筛选出改善睡眠效果最佳的物质并探究其改善睡眠的机制,最后将其开发成具有改善睡眠功效的复合组合物。结果表明,四种活性物均能降低与线虫睡眠相关的活性氧水平,且α-乳白蛋白改善线虫与睡眠相关的氧化应激效果最佳。经α-乳白蛋白干预后,线虫线粒体损伤减少了65.00%(P<0.05),并且应激胁迫下线虫最大寿命显著延长了4.10%(P<0.05)。最后,含α-乳白蛋白复合组合物促睡眠效果最佳的配方不仅能将线虫发育阶段睡眠的睡眠时长和睡眠频率分别提高7.97%(P<0.05)和59.43%(P<0.05),还能显著降低线虫应激诱导睡眠的运动速率。综上所述,四种活性物中,改善线虫睡眠相关氧化应激效果最佳的是α-乳白蛋白并且其改善睡眠的机制与线粒体修复有关,含α-乳白蛋白复合组合物具有改善线虫睡眠的作用。

槲皮素-3-O-葡萄糖苷抑制α-乳白蛋白非酶糖基化机制分析

以牛α-乳白蛋白(bovineα-lactalbumin,α-La)和果糖为非酶糖基化模型,分析槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-glucuronide,Q3G)对α-La非酶糖基化过程中果糖胺和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)形成及游离氨基含量和褐变度的影响,然后结合分子对接和质谱鉴定技术进一步揭示其对非酶糖基化的抑制机理。结果表明:Q3G能显著减轻糖基化过程中的褐变程度,增加游离氨基含量,抑制果糖胺和5-HMF的形成,延缓糖基化反应的进程,且Q3G添加量为2 mmol/L时效果最好。分子对接结果表明Q3G可通过氢键、范德华力和疏水相互作用与α-La的活性氨基酸残基进行结合,影响α-La和果糖的糖基化反应,缓解糖基化反应的进程。同时,超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱分析也发现Q3G屏蔽了糖基化的潜在活性位点Lys93和Lys108,且新增糖基化位点Lys98的糖基化活性较弱,可达到抑制非酶糖基化的作用。本研究可为Q3G作为潜在抗糖基化剂的开发提供理论基础。

α-乳白蛋白对婴幼儿生长发育的影响研究进展

乳白蛋白是哺乳动物和人类乳汁中的一种钙结合蛋白,占母乳总蛋白质的20%~25%,其结构与溶菌酶相似,含有丰富的赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和色氨酸等必需氨基酸,具有多种营养保健功能,在食品生产中具有广阔的应用发展前景,受到大众广泛的关注。目前,我国6月龄以下纯母乳喂养率低,婴幼儿配方乳粉与母乳对婴儿健康生长至关重要。大量研究表明α-乳白蛋白能够促进神经发育、调节睡眠节律并改善抑郁情绪;还能够提高铁和锌的吸收利用率、促进消化道功能完善和胃肠道发育,对于婴幼儿早期的营养至关重要。本文从α-乳白蛋白的氨基酸组成和结构,对婴幼儿体格、大脑神经以及胃肠道发育的影响等方面综述了国内外相关研究进展,以期为婴幼儿配方乳粉的升级和“母乳化”的推广应用提供理论参考。

不同长度糖链对α-乳白蛋白过敏表位^(13)KDLKGYGGVSLPEW^(26)结构和致敏性的影响

α-乳白蛋白的过敏表位是影响其致敏性强弱的分子基础,本文研究不同长度的糖链对其过敏表位结构和致敏性的影响。先合成α-乳白蛋白的IgE线性过敏表位(^(13)KDLKGYGGVSLPEW26,13K-W^(26)),选用葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖对其进行糖基化修饰,采用光谱、色谱分析其结构的变化;运用ELISA和细胞实验等方法来评价其IgE结合能力和KU812细胞释放组胺、白介素-4和白介素-6的能力。结果表明:不同长度的糖链与13K-W26发生糖基化反应后,降低其游离氨基含量,改变其荧光强度和紫外吸收强度,同时降低其IgE结合能力和KU812细胞中组胺、白介素-4和白介素-6的释放能力。因此,不同长度的糖链能改变13K-W26的结构,降低其致敏性,顺序为麦芽五糖>麦芽三糖>麦芽糖>葡萄糖。糖链可遮蔽α-乳白蛋白的线性表位13K-W26,糖链越长,遮蔽作用越强,致敏性消减效果越好。

α-乳白蛋白与β-酪蛋白预防炎症的协同作用研究

牛乳中酪蛋白比例高,而母乳中乳清蛋白含量高,α-乳白蛋白、β-酪蛋白作为母乳中主要的乳清蛋白和酪蛋白,以α-乳白蛋白和β-酪蛋白为研究对象,利用脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞炎症反应,探究不同比例的组合蛋白对细胞炎症的预防作用,探索乳清蛋白和酪蛋白的最佳配比,使婴配粉更贴合母乳。结果表明,添加α-乳白蛋白和β-酪蛋白单体能改变炎症因子mRNA和蛋白水平的表达,然而当混合比例为1:0.17时效果最佳,能显著降低白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)、髓样分化基因88(MyD88)、Toll样受体4(TLR4)在mRNA水平的表达,在蛋白水平降低IL-61.99倍、白介素1β(IL-1β)3.91倍、肿瘤坏死因子α(TNF-α)2.72倍。通过抑制非TLR4介导炎症信号通路关键蛋白NF-κB p65的磷酸化抑制炎症的发生。本研究明确了α-乳白蛋白和β-酪蛋白预防炎症发生的最佳比例,初步阐明了两者协同抗炎的作用机理,为其在婴幼儿配方奶粉中的精准添加提供理论支持和技术指导。

高效液相色谱法测定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

采用HPLC法测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白及β-乳球蛋白的含量,其测定条件为:Agilent-C8(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,流动相A为含0.5%三氟乙酸的乙腈,流动相B为含0.1%三氟乙酸的超纯水,采用梯度洗脱的方法,流速1 mL/min,柱温25℃,检测波长280 nm。结果表明,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的回收率均>92%,RSD<5%。该方法适合测定样品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建

采用RT-PCR技术克隆牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的全长基因,并根据序列设计带有酶切位点的特异性引物对所得cDNA的开放阅读框进行扩增,将所得基因片段克隆到PET-28a载体.结果克隆了牛乳主要过敏原α-乳白蛋白的完整基因,所克隆的基因开放阅读框全长为429 bp,编码142个氨基酸,该蛋白相对分子质量约为16 265,等电点为6.10,与理论值相符.通过与Genbank中已有序列比对分析,同源性高达100%.实现构建该基因的PET-28a原核表达载体,为牛乳主要过敏原α-乳白蛋白基因的相关研究奠定了基础.

α-乳白蛋白提高β-胡萝卜素乳液稳定性

为了提高β-胡萝卜素乳液稳定性,该研究利用α-乳白蛋白(α-LA)为乳化剂,考察了不同α-LA添加量(0.25%~3.00%)对10%的水包油(O/W)β-胡萝卜素乳液粒径、电位、快速稳定性、包埋率、界面α-LA含量和化学稳定性的影响。结果表明:随着α-LA添加量的增加,β-胡萝卜素乳液粒径减小,电位增加,包埋率提高;当α-LA添加量大于1.50%时,乳液粒径、电位和包埋率不再随着α-LA添加量的增加而变化(P>0.05)。乳液的Turbiscan扫描指数(TSI)在α-LA添加量大于1.50%之后没有显著性变化,β-胡萝卜素乳液趋于稳定。随着α-LA添加量的增加,水油界面上α-LA含量显著增加(P<0.05)。当α-LA添加量大于1.00%时,β-胡萝卜素在乳液中的保留率不再随着α-LA添加量的增加而增加。研究结果表明α-LA是一种可以应用在β-胡萝卜素乳液中的乳化剂,在α-LA添加量为1.50%时,可以得到物理和化学稳定性较好的β-胡萝卜素乳液,为食品工业中应用β-胡萝卜素提供了参考。

高效液相色谱法测定牛乳中α-乳白蛋白

利用常规的C18色谱柱的高效液相色谱建立测定牛乳中主要过敏蛋白α-乳白蛋白含量的方法。色谱条件:色谱柱Alltima-C18(4.6 mm×200 mm,5μm),柱温为45℃,UV检测波长215 nm,流动相A为含0.1%三氟乙酸的超纯水,流动相B为乙腈:超纯水:三氟乙酸=400:100:0.5,采用梯度洗脱方法,流速0.8 mL/min。结果表明:α-乳白蛋白的线性范围分别为50～1 000μg/mL(r=0.990 9);α-乳白蛋白平均回收率为97.27%,RSD=0.76%(n=5);该方法简便、准确,适合于乳制品中α-乳白蛋白含量的测定。

牛α-乳白蛋白-亚油酸复合物的结构及抗肿瘤活性

利用内源性荧光光谱、荧光探针(ANS)结合荧光光谱及圆二色谱,以乳白蛋白-油酸为参照,研究了乳白蛋白结合亚油酸后,疏水性氨基酸、疏水性区域、三级结构及二级结构的变化,并利用亚甲基蓝的方法评价了该复合物的抗肿瘤活性。荧光光谱结果显示,与乳白蛋白-油酸复合物类似,乳白蛋白结合亚油酸后,其内源性荧光光谱显著红移,从331.07nm移至337.60nm;外源性ANS结合光谱蓝移,从516.20nm移至508.50nm;且荧光强度增加,表明乳白蛋白结合亚油酸后同样出现了疏水性氨基酸及疏水性区域暴露的现象。圆二色谱结果表明,与乳白蛋白-油酸复合物类似,乳白蛋白结合亚油酸后,三级结构部分丧失,二级结构中β-转角及无规卷曲的含量显著降低,β-折叠含量增加。细胞实验证实了乳白蛋白-亚油酸复合物具有良好的抗肿瘤效果。该研究从复合物结构和功能的两方面,为新型抗肿瘤乳白蛋白-亚油酸复合物的开发提供了依据。

脱脂乳发酵过程中β-乳球蛋白和α-乳白蛋白抗原性变化规律

选择8株乳酸菌对脱脂乳进行发酵,通过间接竞争ELISA法测定了不同菌种、发酵时间、冷藏时间下发酵乳中β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)的残留抗原性。结果表明,经不同乳酸菌发酵12h后,发酵乳中β-LG和α-LA的抗原性均出现不同程度的下降,且菌株间差异显著。随着发酵时间的延长,β-LG和α-LA的抗原性在3～12h内迅速下降,下降速度为瑞士乳杆菌>保加利亚乳杆菌>嗜热链球菌,复合菌株发酵对降低抗原性具有协同效果;继续发酵至48h,抗原性变化缓慢。瑞士乳杆菌发酵乳在4℃冷藏7d后,与冷藏前相比,α-LA的抗原性下降5%左右,而β-LG的抗原性无显著变化。

牛乳α-乳白蛋白IgE线性表位的关键氨基酸识别

α-乳白蛋白是引起牛乳过敏的主要过敏原之一。识别α-乳白蛋白作用表位及影响致敏性的关键氨基酸,对于揭示α-乳白蛋白致敏机理及低致敏乳制品的开发具有重要的意义。本研究采用固相合成技术合成α-乳白蛋白系列多肽,以牛乳过敏患者血清为探针,通过酶联免疫吸附分析法识别α-乳白蛋白的作用表位和关键氨基酸。结果表明:免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)E作用表位的氨基酸序列定位为aa1-15、aa6-20、aa46-60、aa71-85和aa101-115。α-乳白蛋白IgE作用表位关键氨基酸为第8位的缬氨酸、第9位的苯丙氨酸、第10位的精氨酸、第103位的酪氨酸、第105位的亮氨酸和第107位组氨酸。本研究可以为过敏原c DNA克隆以激活T细胞、降低IgE结合能力提供重要思路。

膜分离法制备高α-乳白蛋白质量分数的乳清蛋白浓缩物80

采用微滤和超滤结合制备乳清蛋白浓缩物80(Whey protein concentrate,WPC80),所制得的WPC80中α-乳白蛋白质量分数占总蛋白的64.37%。本研究采用0.2μm的聚偏氟乙烯去除甜乳清溶液中的脂肪和酪蛋白等,使得脂肪质量分数由0.15%降低至0.03%;比较分析了p H值为4.30时,乳清溶液50 ku聚偏氟乙烯和50 ku聚醚砜对α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分离效果,其中50 ku聚偏氟乙烯的平均膜通量和α-乳白蛋白的得率都显著低于50 ku聚醚砜,但α-La纯度和对α-La的选择透过性(即α-La/β-Lg)显著高于50 ku的聚醚砜,综合考虑,50 ku的聚偏氟乙烯更适合于生产高α-La质量分数的WPC80。

高效毛细管电泳测定α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A及β-乳球蛋白B的纯度

采用毛细管电泳分析手段,用校正峰面积归一化法同时测定了本实验室购得的α-Lac、β-LgA及β-LgB三个蛋白参考物的纯度,其值分别为75.4%、84.5%和76.9%,相对标准偏差分别为1.6%、0.7%及1.4%。所得结果与应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法的测定结果进行了比较,并讨论了造成二者差异的原因。结果表明毛细管电泳法是分析此类蛋白的有效潜在手段。

牦牛乳清中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的热聚合反应

通过使用体积排阻色谱法检测不同加热温度和不同加热时间对牦牛乳清蛋白形态及质量分数变化的影响。当加热温度达到80~90℃溶液中蛋白发生了不同程度的聚合,蛋白聚合质量分数随着加热温度及加热时间的增长呈现上升趋势,同时α-乳白蛋白与β-乳球蛋白含量明显降低。当加热温度未达到80℃时,溶液中没有蛋白聚合的产生。结果表明,当加热温度高于β-乳球蛋白的变性温度会导致蛋白聚合的产生,同时表明β-乳球蛋白在蛋白聚合中起主导地位。

HPLC凝胶过滤色谱法测定牛奶及其乳制品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

建立了一种基于凝胶柱高效液相色谱的分析方法,可以一次性定量分离牛奶及乳制品中的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白.组分分离度达到1.0,达到基线分离,回收率大于90%,相对标准偏差0.4%~3.1%.该方法不需对样品进行离心,简化了操作程序,减少了有效成分的流失,提高了蛋白质的回收率,具有准确、灵敏和迅速等特点,可用于牛奶及其乳制品的质量控制和定量检测.

CE法检测α-乳白蛋白和β-乳球蛋白

建立区带毛细管电泳法分离检测乳粉中α-乳白蛋白(α-Lac)和β-乳球蛋白(β-Lg)含量的分析方法,检测条件为未涂层柱子、60 mmol/L磷酸盐缓冲体系(pH 6.5)、检测波长214 nm、分离电压15 kV。应用本法对市场上10个品牌的13个婴幼儿乳粉样品进行了检测,具有成本低廉、操作简便、准确快速等优点。

牛奶α-乳白蛋白基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

采用Taqman探针技术,建立食品中牛奶过敏原α-乳白蛋白基因的实时荧光定量PCR检测方法。根据α-乳白蛋白基因序列设计特异性引物及Taqman探针进行PCR扩增,构建质粒,经酶切鉴定测序后,建立拷贝数（copies）-Ct标准曲线。成功克隆α-乳白蛋白目的基因,建立的标准曲线在1.12×10^3-1.12×10^8 copies范围内线性关系良好,灵敏度高,液体样品检测限达到1 000copies/mL,特异性强,稳定性好。该法可用于实际商品中牛奶过敏原α-乳白蛋白组分的定量检测。