γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch通路并纠正脑卒中后抑郁大鼠Th17/Treg失衡

目的:探究γ-分泌酶抑制剂DAPT对Notch信号通路和脑卒中后抑郁(PSD)大鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞(Th17/Treg)失衡的影响。方法:SD大鼠采用线栓法结合慢性不可预知性温和应激(CUMS)刺激及孤养建立PSD模型,随机分为PSD组(等量生理盐水)和DAPT组(5 mg/kg DAPT),假手术(sham)组(等量生理盐水)为对照,每组10只。各组大鼠分别于术前(0 d)及术后7、14、21和28 d进行体重检测、敞箱实验(OFT)及蔗糖偏爱实验(SPT)。干预结束后,采用RT-qPCR和Western blot分别检测脑组织海马Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表达水平,流式细胞术检测外周血单个核细胞(PBMC)中Th17和Treg细胞比例,ELISA法检测血清白细胞介素17(IL-17)和IL-10水平。结果:术后7、14、21和28 d,与sham组比较,PSD组大鼠体重、水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗比例均显著降低(P<0.05),其中7和14 d PSD组与DAPT组大鼠体重、水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗比例差异无统计学意义(P>0.05);与PSD组比较,21和28 d DAPT组大鼠体重、水平运动评分、垂直运动评分和糖水消耗比例显著增加(P<0.05)。干预结束后,与sham组比较,PSD组大鼠海马Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表达水平,PBMC中Th17细胞比例和Th17/Treg比值,以及血清IL-17水平显著升高(P<0.05),Treg细胞比例和血清IL-10水平显著降低(P<0.05);与PSD组比较,DAPT组大鼠海马Notch1和Hes1 mRNA及蛋白表达水平,PBMC中Th17细胞比例和Th17/Treg比值,以及血清IL-17水平显著降低(P<0.05),Treg细胞比例和血清IL-10水平显著升高(P<0.05)。结论:DAPT可阻断Notch信号通路并减轻PSD大鼠抑郁样症状,其机制可能与调节Th17/Treg失衡及炎症因子分泌有关。

γ-分泌酶抑制剂在哮喘小鼠模型Th17/Treg平衡失调中的作用

目的研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对哮喘气道炎症、气道高反应和Th17/Treg失衡的干预作用,为其抗哮喘活性制剂的研究与开发提供理论依据。方法 6-8周雌性C57BL/6小鼠45只被随机分为对照组,哮喘组和DAPT组,每组15只苏木精-伊红(HE)染色法观察气道病理改变,酶联免疫吸附法检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞因子和炎性介质的水平,逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)分析脾脏Foxp3 mRNA的表达。结果 DAPT组较哮喘组气道炎症明显减轻,气道内黏液分泌显著减少。哮喘组IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分别为(695±148)ng/ml,(58±6)pg/ml,(148±12)pg/ml,(18±3)pg/ml;DAPT组IgE、IL-17、IL-10和TGF-β1的含量分别为(486±152)ng/ml,(27±6)pg/ml,(193±17)pg/ml,(33±5)pg/ml。与哮喘组比较,DAPT组气道灌洗液中IL-17、IgE水平显著降低(P<0.01),IL-10、TGF-β1水平显著增加(P<0.01),Foxp3 mRNA的表达也显著增加(P<0.01)。结论γ-分泌酶抑制剂DAPT具有抗哮喘小鼠Th17/Treg失衡的作用。

γ-促分泌酶抑制剂对毛细支气管炎模型大鼠体内Th17细胞分化的影响

目的:研究γ-促分泌酶抑制剂阻断Notch信号对毛细支气管炎(简称毛支)模型大鼠Th17细胞发育和分化的影响,为毛支治疗寻找新的药物提供理论基础。方法:按随机对照原则将SD大鼠分为正常组、毛支组和γ-促分泌酶抑制剂组,滴鼻法成功建立毛支模型,而后尾静脉注射γ-促分泌酶抑制剂MW167,通过HE染色观察肺组织病理改变,ELISA检测血浆中白介素17(IL-17)的水平,实时荧光定量PCR检测肺组织和外周血单个核细胞中RORγt mRNA的表达,Western blot检测肺组织中Notch信号、RORγt的蛋白表达。结果:与毛支组相比,MW167组肺组织病理学改变减轻;血浆IL-17水平也较毛支组降低;肺组织及外周血单个核细胞RORγt mRNA在MW167注射组表达均减弱;MW167组肺组织Notch信号和RORγt蛋白的表达也显著降低。结论:静脉注射γ-促分泌酶抑制剂能够通过阻断Notch信号通路抑制Th17细胞的分化,缓解毛支模型大鼠的气道炎症,对毛支有潜在的治疗价值。

α分泌酶在阿尔茨海默病中的研究进展

淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）经过淀粉样代谢途径（β、γ分泌酶）产生Aβ,Aβ不同程度的聚集能够促进AD的发生、发展,而APP经过非淀粉样代谢途径（α、γ分泌酶）则产生可溶性片段s APP a,s APP a具有神经营养和保护作用,能竞争性的减少Aβ的产生,从而延缓AD的发展。

Notch1信号通路通过调控Th17细胞参与实验性自身免疫性甲状腺炎的发生和发展

目的探讨Notch1信号通路是否通过调控辅助性T细胞17(Th17)参与实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)的发生和发展。方法将24只小鼠随机平均分为NC组、EAT-A组(给予猪甲状腺免疫球蛋白多点皮下注射)、EAT-B组(猪甲状腺免疫球蛋白多点皮下注射前给予γ分泌酶抑制剂腹腔注射)。HE染色观察甲状腺内淋巴细胞浸润程度;流式细胞术检测小鼠脾脏单核细胞(SMC)悬液中Th17细胞比例;ELISA法检测血清甲状腺球蛋白(TgAb)滴度和SMC培养上清白细胞介素-17A(IL-17A)浓度;实时PCR分析脾细胞中Notch1、Hes1、RORγt和IL-17A mRNA表达水平;Western blotting检测脾脏组织中IL-17A蛋白表达水平。结果EAT-A组和EAT-B组小鼠甲状腺中有不同程度淋巴细胞浸润,与NC组相比血清TgAb滴度显著升高(P<0.01)。EAT-A组和EAT-B组小鼠Notch1、Hes1、RORγt和IL-17A mRNA表达,以及SMC中Th17细胞比例、IL-17A浓度、IL-17A蛋白表达水平均高于NC组(均P<0.01)。EAT-B组上述指标显著低于EAT-A组(均P<0.01)。EAT-A组小鼠SMC中Th17细胞比例与血清TgAb滴度、脾脏Notch1 mRNA及IL-17A蛋白表达水平均呈正相关。结论EAT小鼠中Notch1信号通路的表达上调,阻断此信号通路后小鼠甲状腺炎症程度减轻,同时伴有Th17细胞比例明显降低,提示Notch1信号通路可能通过调控Th17细胞参与EAT的发生和发展。

APP17肽对APP转基因小鼠Aβ相关蛋白表达的影响

目的研究淀粉样前体蛋白(APP)17肽对APP转基因小鼠(APPV717I)海马神经元β淀粉样肽(Aβ)相关蛋白表达的影响。方法将3月龄的APP转基因小鼠随机分为模型组和APP17肽治疗组(隔日皮下注射0.16mg·kg-1,3次/w),并以相同年龄未经转基因处理的C57BL/6J小鼠做正常对照组。8个月后行Morris水迷宫测定,小鼠脑组织灌注固定后进行Aβ1～42、Aβ1～16、APP-N端(52～80)、早老蛋白-1(PS-1)C端、APP的β位点剪切酶(BACE)等蛋白的免疫组化染色。结果模型组小鼠水迷宫实验的逃避潜伏期明显长于APP17肽治疗组和正常对照组(P<0·05),且模型组小鼠海马中Aβ1～42、Aβ1～16、APP-N端(52～80)、PS-1C端、BACE阳性反应神经元明显增加,染色深(P<0·05);APP17肽治疗组与正常对照组相近。结论APP转基因小鼠大脑中存在Aβ相关蛋白的高表达,由此引起记忆、学习能力的改变;而APP17肽能通过抑制β-分泌酶和PS-1的表达而减少Aβ生成,使之接近正常,并能改善小鼠的记忆、学习能力。

脑慢性低灌注老龄大鼠海马ε型蛋白激酶C及α分泌酶ADAM17表达的变化

目的观察脑慢性低灌注对老龄大鼠海马组织ε型蛋白激酶C(PKCε)及α分泌酶ADAM17蛋白表达的影响。方法将老龄大鼠随机分为假手术组和低灌注组,低灌注组永久性阻断双侧颈总动脉,制作脑慢性低灌注模型;采用Y型电迷宫分别于术后14和28d检测大鼠学习记忆能力;采用免疫组化法和免疫印迹法检测上述时间点海马组织PKCε和ADAM17的表达。结果低灌注组术后14和28d学习记忆能力较假手术组减退(P<0.01);与假手术组比较,低灌注组术后各时间点大鼠海马PKCε和ADAM17表达明显下降(P均<0.01)。结论脑慢性低灌注损害老龄大鼠学习记忆能力,导致痴呆发生,其机制可能与海马PKCε表达下降有关,而PKCε参与调节α分泌酶的表达,推测PKCε表达的下调,导致ADAM17表达减少,间接促进β淀粉样蛋白(Aβ)生成,损伤脑组织形成痴呆。

Notch信号途径对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡调节的机制

目的:探究Notch信号途径对过敏性鼻炎小鼠调节性T细胞/辅助性T细胞17(Treg/Th17)细胞免疫失衡的调节机制。方法:30只BALB/c小鼠均分为对照组、模型组及Notch信号途径抑制剂分泌酶抑制剂(γ-DAPT)组,模型组和γ-DAPT组于第1、7、14及第21~27天采用卵清蛋白(OVA)+氢氧化铝[AL(OH)3]滴鼻诱导过敏性鼻炎,γ-DAPT组在刺激前30 min鼻内滴注20μLγ-DAPT(10μg);末次局部刺激后,流式细胞仪检测各组小鼠鼻黏膜组织Treg及Th17细胞比例,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清白细胞介素(IL-10、IL-17)和转化生长因子β(TGF-β)水平,实时荧光定量PCR和蛋白印迹(Western blot)法检测鼻黏膜组织中Notch1、配体分子Jagged1及下游产物Hes1的表达。结果:与对照组比较,模型组小鼠行为学评分、Th17细胞比例及血清IL-17水平明显升高,鼻黏膜组织Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表达上调,Treg细胞比例及血清IL-10、TGF-β水平降低(P<0.05);与模型组比较,γ-DAPT组行为学评分、Th17细胞比例及血清IL-17水平明显降低,鼻黏膜组织Notch1、Jagged1及下游Hes1 mRNA及蛋白表达下调,Treg细胞比例及血清IL-10、TGF-β水平升高(P<0.05)。结论:Notch信号途径可能参与过敏性鼻炎的致病机制,其抑制剂γ-DAPT可纠正Treg/Th17细胞免疫失衡,从而减轻过敏性鼻炎症状。

铝对大鼠脑内Aβ蓄积及α-分泌酶各亚型表达变化的影响

目的探讨α-分泌酶在铝引起脑内β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)蓄积中的作用。方法健康雄性SD大鼠32只,按体重随机分为4组,对照组(生理盐水组),低剂量组(0.4 mg/kg),中剂量组(0.8 mg/kg)和高剂量(1.2 mg/kg)组,每组8只。染毒结束后,采用ELISA检测大鼠皮质和海马Aβ的量。用Western-blot检测大鼠脑皮质和海马中α-分泌酶各亚型(ADAM9、ADAM10及ADAM17)的表达情况。结果随染毒剂量的增高,皮质和海马内Aβ总量增高,与对照组相比,皮质内高剂量组Aβ总量(Aβ40和Aβ42总和)增高有统计学意义(P<0.05),在海马内中、高剂量组Aβ总量增高有统计学意义(P<0.05);其中Aβ40变化不明显,在皮质和海马内各染毒组与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);而Aβ42有显著增高,与对照组相比,皮质内高剂量组Aβ42增高,差异有统计学意义(P<0.05),海马内低、中、高剂量组Aβ42增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,各染毒组大鼠脑皮质ADAM9表达量差异无统计学意义(P>0.05),在海马内中、高剂量组ADAM9表达量显著降低(P<0.05);在皮质和海马内,ADAM10表达量在低、中、高剂量组均显著降低(P<0.05),ADAM17表达量在脑皮质和海马内中、高剂量组显著降低(P<0.05)。结论铝可以引起大鼠脑皮质和海马Aβ水平升高,α-分泌酶水平的降低是铝引起大鼠脑内Aβ蓄积的重要原因之一。

17β-雌二醇对解聚素金属蛋白酶9表达水平的影响

目的研究17β-雌二醇对解聚素金属蛋白酶9（ADAM9）表达水平的影响。方法应用盐析法提取人类基因组DNA，扩增ADAM9基因启动子目的片断，构建表达ADAM9启动子的报告基因质粒。应用脂质体转染法，分别转染人人神经母细胞瘤细胞SK．N—SH、人胚肾细胞HEK293和宫颈癌细胞HeLa内。17β-雌二醇处理各组细胞后，检测ADAM9启动子转录效率。结果成功扩增了ADAM9启动子区1676bp目的片段，构建了ADAM9启动子报告基因质粒pGL．ADAM9，瞬时转染入细胞内。17β-雌二醇处理SK_N．SH细胞后，ADAM9启动子转录活性上升至31．250＋1．328，较处理前的15．471＋1．256增加约2倍，差异有统计学意义（P〈0．05）。HEK293细胞内，ADAM9启动子转录活性上升至13．499＋0．866，较处理前的8．513＋1．356增加约1．6倍，差异有统计学意义（氏0．05）。HeLa细胞中没有观察到1713．雌二醇对ADAM9启动子转录活性的影响。结论17B．雌二醇能上调人ADAM9启动子的表达水平，是ADAM9基因表达的激活剂。

小鼠大脑皮层中ADAM17表达的降低对神经元前体细胞外向迁移的抑制作用

在发育过程中神经元前体细胞的外向迁移对于大脑皮层的多层结构建立有着重要作用.金属蛋白酶家族的成员ADAM17(A Disintegrin And Metalloprotease 17)对于多种膜蛋白的成熟释放有着重要作用,包括多个表皮生长因子受体的配体以及Notch等蛋白.这些底物中有多个对神经干细胞的增殖、分化、迁移都有重要作用.为了探讨ADAM17在大脑皮层发育过程中的生理作用,结合RNAi和IUE的技术,降低小鼠大脑发育阶段中ADAM17的表达.结果显示:用RNAi降低ADAM17在小鼠大脑皮层发育14—18d中的表达,会造成神经元前体细胞的外向迁移障碍,使得细胞停留在脑室下区.

Notch1信号通路调控γδT17细胞表达参与EAT小鼠甲状腺自身免疫损伤

为探讨γ-分泌酶抑制剂阻断Notch1信号通路对实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)小鼠γδT17细胞表达及甲状腺自身免疫损伤的影响,将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常对照(normal control,NC)组(n=10)、EAT-A组[给予猪甲状腺免疫球蛋白(porcine thyroid immunoglobulin,pTg)多点皮下注射,n=10]、EAT-B组{pTg皮下注射前给予γ-分泌酶抑制剂3,5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t-丁酯[N-(N-3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT]腹腔注射,n=10}。应用H-E染色、ELISA、流式细胞术、qRT-PCR等评估甲状腺炎症程度,检测γδT17细胞比例及其效应细胞因子IL-17A、Notch1信号通路主要组分的表达水平。结果显示,EAT-A组小鼠血清甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TgAb)滴度,IL-17A水平,γδT17细胞比例,Notch1、发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split1,Hes1)及IL-17A mRNA表达水平均显著高于NC组(P<0.01)。EAT-B组小鼠经DAPT处理后上述指标均显著下降(P<0.01),伴有甲状腺内淋巴细胞浸润程度减轻。EAT小鼠γδT17细胞比例与血清TgAb滴度及IL-17A水平均呈正相关(r值分别为0.598、0.497,P<0.05)。该研究提示,γ-分泌酶抑制剂可能通过阻断Notch1信号通路下调EAT小鼠γδT17细胞表达,减轻甲状腺自身免疫损伤。

规律性运动对APP／PS1小鼠学习记忆能力的影响

目的探讨有规律的适宜运动对AD模型小鼠的学习记忆能力的影响。方法雌性C57BL／c野生型小鼠及APP／PSl转基因小鼠，经过6个月规律性运动后，测定小鼠α-分泌酶／ADAMl0活性，A8及学习记忆行为学变化。结果规律性运动6个月不仅大大提高了在野生型小鼠的学习记忆行为，而且还改善AD转基因小鼠在学习和记忆障碍，提高了在野生型小鼠及AD转基因小鼠的α-分泌酶活性，抑制Aβ40和Aβ42的产生。结论提示规律性运动可能通过增加α-分泌酶活性，抑制脑内Aβ的生成量，参与了运动对学习记忆的作用。