糖尿病大鼠神经功能、形态和半乳糖神经酰胺转移酶的变化

目的 观察早期糖尿病大鼠坐骨神经半乳糖神经酰胺转移酶(CGTmRNA)的变化,及其与神经功能、形态的关系。方法 以链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型,用电生理测定坐骨神经传导速度,光镜、电镜观察坐骨神经形态,半定量RT-PCR方法测定坐骨神经CGTmRNA。结果 糖尿病4周时,坐骨神经传导速度均明显减慢,超微结构改变,而CGTmRNA表达无明显变化;8周时,坐骨神经有明显的形态学改变,CGTmRNA表达明显增高。结论 糖尿病多发性神经病(DPN)时坐骨神经CGTmRNA表达上调;其出现于神经功能和形态损伤后。

5-氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体的抗耐药作用及部分机制研究

目的研究5氟尿嘧啶半乳糖神经酰胺脂质体(5FuGCL)体外对耐5FuHepG2细胞株的抑制作用并对其抗耐药机制进行探讨。方法在建立耐5Fu的HepG2细胞株模型的基础上,采用MTT法检测5FuGCL对其的抑制作用。另外,通过高效液相法(HPLC)检测细胞内液的药物含量、免疫组化法检测胸苷酸合酶(TS)的表达、化学法检测NO含量等研究其抗耐药作用机制。结果5FuGCL(75,150,300,600,1200μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞株有明显的抑制作用,IC50为158.6μmol·L-1,远小于游离5Fu(400.9μmol·L-1);5FuGCL(300μmol·L-1)对耐5Fu的HepG2细胞的抑制作用随时间的延长而增强,其中(24～48h)的抑制作用明显强于相同浓度的游离5Fu。5FuGCL(300μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu比较,能明显增加药物进入HepG2细胞内液的程度;5FuGCL(75,300,1200μmol·L-1)既可明显降低TS的表达,又可显著增加NO的含量,且5FuGCL(300,1200μmol·L-1)与相同浓度的游离5Fu相比,其作用明显增强。结论5FuGCL有明显的抗5Fu耐药作用,这可能是通过增加细胞内液5Fu的含量,抑制TS的表达和增加NO含量实现的。

α-半乳糖神经酰胺对小鼠肺iNKT细胞数量、活性和气道炎症反应的影响

目的观察α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)对小鼠肺iNKT细胞数量、活性和气道炎症反应的影响。方法 12只野生型Balb/c小鼠随机分为α-GalCer治疗组和正常对照组,每组6只;12只CD1d^(-/-)Balb/c小鼠随机分为CD1d^(-/-)α-GalCer治疗组和CD1d^(-/-)对照组,每组6只。野生型和CD1d^(-/-)α-GalCer治疗组小鼠单次腹腔注射α-GalCer 2μg,并用等量PBS对照。分别采用流式细胞仪检测小鼠肺iNKT细胞、IL-4^+和IFN-γ^+i NKT细胞的数量;HE和PAS染色观察肺组织炎症和气道杯状细胞增生;姬姆萨染色检测肺泡灌洗液(BALF)细胞总数和分类计数;ELISA法检测BALF中IL-4、IL-5、IL-10、IL-13水平和脾细胞培养上清液中IL-4、IL-5、IL-13水平。结果野生型α-GalCer治疗组小鼠肺iNKT细胞、IL-4^+和IFN-γ^+i NKT细胞的数量明显高于野生型正常对照组(P<0.05)。野生型α-GalCer治疗组小鼠肺组织无炎症改变和基底膜杯状细胞增生;BALF中细胞总数和分类计数、BALF及脾细胞培养上清液中IL-4、IL-5和IL-13水平与野生型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生型α-GalCer治疗组小鼠BALF中IL-10水平明显高于野生型正常对照组(P<0.01),但CD1d^(-/-)α-GalCer治疗组小鼠BALF中IL-10水平与野生型正常对照组和CD1d^(-/-)对照组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论腹腔注射α-GalCer可以增加小鼠肺iNKT细胞数量和活性,但不能诱导气道炎症反应。

园艺作物果实β-半乳糖苷酶研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶GH35家族,参与了植物不同生长阶段细胞壁的合成与修饰,尤其对肉质水果发育和成熟过程中多糖的裂解具有重要作用。文章概述了β-半乳糖苷酶的蛋白功能、不同亚型、亚细胞定位和活性规律,重点阐述了该基因家族在园艺作物果实质地变化中的作用及相关研究进展。

适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215通过调控能量代谢酶保护脂多糖/D-氨基半乳糖诱导的急性肝衰竭小鼠机制研究

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂ACY1215对急性肝衰竭(ALF)小鼠的保护作用及其可能的作用机制。方法将30只小鼠随机分为对照组、模型组和ACY1215处理组,采用脂多糖和D-氨基半乳糖联合腹腔注射诱导小鼠ALF模型,常规行血生化和组织病理学检查,采用Western blot法检测肝组织苹果酸脱氢酶1(MDH1)、异柠檬酸脱氢酶(IDH1)和果糖-2,6-二磷酸酶2(PFKFB2)及白介素-1β(IL-1β)和IL-18分子蛋白的表达。结果肝组织病理学检查显示,ALF模型制备成功,而ACY1215干预组肝组织病理学损害显著减轻;模型组血清ALT、AST和TBIL水平分别为(3743.5±655.9)U/L、(2539.4±488.1)U/L和(89.56±7.2)μmol/L,显著高于对照组【分别为(34.5±7.6)U/L、(32.3±9.3)U/L和(6.2±2.4)μmol/L,P<0.05】,而ACY1215处理组各项指标均显著降低【分别为(951.5±328.9)U/L、(475.3±131.24)U/L和(38.41±9.5)μmol/L,P<0.05】;模型组小鼠肝组织MDH1和IDH1表达较对照组显著减弱,PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较对照组显著增强,而ACY1215干预组肝组织MDH1和IDH1表达较模型组显著增强,而PFKFB2、IL-18和IL-1β表达较模型组显著减弱。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂ACY1215可以通过对能量代谢酶的调节发挥保护ALF小鼠的作用。

索拉非尼半乳糖神经酰胺固体脂质纳米粒的研制

目的研制索拉非尼半乳糖神经酰胺固体脂质纳米粒(S-GC-SLN)混悬液。方法采用乳化蒸发-低温固化法制备S-GC-SLN,正交试验法优选处方,透射电镜观察形态,激光粒度测定仪测定粒径、多分散指数及Zeta电位,采用葡聚糖凝胶柱层析法与HPLC法测定包封率。结果优选处方为:索拉非尼15mg、半乳糖神经酰胺250 mg、泊洛沙姆188 350 mg、蛋黄卵磷脂450 mg。所制脂质纳米粒子为类球形实体,粒径为(186.6±2.6)nm,Zeta电位为(-46.1±2.9)mV,包封率为(83.47±1.54)%。结论乳化蒸发-低温固化法制备S-GC-SLN可行,为开发索拉非尼新制剂提供了实验依据。

普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

β-半乳糖苷酶在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞中的表达变化

目的观察β-半乳糖苷酶(β-gal)在ROSAβgeo26小鼠衍生的神经干细胞(NSCs)中的表达变化。方法体外培养NSCs,并应用X-Gal组织化学和免疫细胞化学染色技术研究NSCs中β-gal的表达变化。结果原代克隆球和亚克隆球的NSCs均稳定表达β-gal;在NSCs分化过程中,NeuN阳性的神经元、GalC阳性的少突胶质细胞和GFAP阳性的星形胶质细胞均表达β-gal,但表达水平有所下降。结论ROSAβgeo26小鼠衍生的NSCs能稳定的表达β-gal,可用作NSCs研究的细胞来源。但在干细胞分化的相关研究中,值得注意存在β-gal不同程度的表达下调现象,并应进一步关注出现该现象的潜在机制。

缺血性脑卒中患者血清中S100B、半乳糖凝集素-3和神经元特异性烯醇化酶的表达及意义

目的检测缺血性脑卒中患者血清中S100B蛋白(S100B)、半乳糖凝集素(Galectin)-3和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,关注其临床价值。方法 59例缺血性脑卒中患者作为观察组,30例经体检成年人血清标本作为对照组,应用酶联免疫吸附法检测两组中S100B、Galectin-3和NSE的表达。结果观察组血清中S100B、Galectin-3和NSE的表达量明显高于对照组,观察组血清中S100B、Galectin-3和NSE的表达量与梗死灶的体积及病变严重程度相关。相关分析显示S100B和NSE具有正相关性,而S100B和Galectin-3、Galectin-3和NSE的表达未见明显相关性。结论缺血性脑卒中患者血清中S100B、Galectin-3和NSE的表达升高,三者不仅可以促进疾病的形成,还对疾病的进展起一定作用。S100B和NSE可能具有一定的协同作用。

丙胺酰谷氨酰胺注射液对食管癌术后患者半乳糖凝集素-3、D-二聚体及环氧合酶-2的影响分析

目的分析丙胺酰谷氨酰胺注射液对食管癌术后患者半乳糖凝集素-3、D-二聚体及环氧合酶-2的影响。方法选择进行食管癌手术的患者148例,随机分为观察组和对照组,采用不同的营养方法,记录2组患者治疗前后的Gal-3,DD、COX-2水平和IgG、IgA、IgM。结果治疗前,2组患者的Gal-3(t=0.288)、DD(t=0.137)、COX-2(t=0.292)水平比较,P均>0.05,差异均无统计学意义。治疗后,2组患者的Gal-3(t=3.847)、DD(t=6.938)、COX-2(t=5.635)水平比较,P均<0.05,差异均具有统计学意义。2组患者治疗后Gal-3、DD、COX-2水平均较治疗前降低,但观察组较对照组降低程度高。治疗前,2组患者的IgG(t=0.109)、IgA(t=0.392)、IgM(t=0.112)水平比较,P均>0.05,差异均无统计学意义。治疗后,2组患者的IgG(t=4.762)、IgA(t=3.727)、IgM(t=3.822)水平比较,P均<0.05,差异均具有统计学意义。2组患者治疗后IgG较治疗前升高,IgA、IgM水平均较治疗前降低,且观察组较对照组变化程度高。结论丙胺酰谷氨酰胺注射液可改善食管癌患者术后体液免疫状况,而且治疗后可显著降低患者的Gal-3、DD、COX-2水平,因此其可用于食管癌患者术后营养治疗。

β-半乳糖苷酶及多聚半乳糖醛酸酶对桃果实成熟软化的影响

以雨花3号桃果实为试验材料,采用气相色谱法测定不同成熟时期桃果实的乙烯释放量以及ACC合成酶和ACC氧化酶活性的变化,并分析β-半乳糖苷酶(-βG al)和多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性的变化,探讨-βG al和PG对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,具有明显的乙烯跃变高峰,ACC合成酶和ACC氧化酶活性变化趋势与乙烯变化相一致;PG活性高峰与乙烯释放高峰同时出现于成熟度Ⅳ,而-βG al活性高峰出现于成熟前期(即成熟度Ⅰ);-βG al不同于PG,其作用主要与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关。

转糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选和鉴定及酶催化生成低聚半乳糖

通过水解活性和转糖基活性筛选,从实验室97株保存菌种中获得1株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌,克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断,GenBank收录号为DQ267829.综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果,将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1.确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖1%,氮源为蛋白胨0.5%和酵母膏0.5%,培养条件为37℃摇床培养18 h;碳源实验证明,该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型.利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响,确定最适反应条件为pH7.5、50 mmol/L(磷酸缓冲液)配制的40%乳糖溶液,55℃反应24 h.转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68%,双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02%,葡萄糖26.37%和半乳糖14.92%.

对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖法测定饲用α-半乳糖苷酶(黑曲霉)活力的方法

旨在建立一种适合于测定饲用α-半乳糖苷酶活力的检测方法。实验利用对硝基酚 -α- D-吡喃半乳糖(p- NPG)作为酶反应底物 ,通过 4 0 0 nm比色检测酶反应所释放的对硝基酚的量来测定饲用酶制剂中 α-半乳糖苷酶的活性。研究表明 ,反应液中所含的对硝基酚的量大于 15 μmol.m L-1时 ,吸光值超过仪器的检测范围 ;酶制剂稀释倍数对对硝基酚比色法的影响较小 ,本底占总酶活的 10 %～ 16 % ,当酶稀释 10 0倍时 ,本底对酶活的影响最小 ;在测定酶活反应时间为 6 min时 ,已经有约 10 %的对硝基酚 - α- D-吡喃半乳糖水解 ,当酶液的酶活在 2 .0 U.m L-1以内 ,测试结果较为准确。考虑到饲用酶制剂的作用环境 ,建议反应温度为 37℃、反应体系 p H 5 .0。

β-半乳糖苷酶的研究与应用

本文对β－半乳糖苷酶进行了比较全面的论述，包括β－半乳糖苷酶的研究概况、来源、性质及其应用，比较了细菌、酵母菌、霉菌产生的β－半乳糖苷酶的特性，并对其应用前景进行了分析。

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了温度、ｐＨ、酶量和起始乳糖浓度对低聚半乳糖合成的影响，发现乳糖水解为单糖和合成低聚糖所需的最佳条件并不相同；利用有机溶剂作反应介质有利于低聚糖合成。在疏水性环己烷／水（９５／５，Ｖ／Ｖ）反应体系中得到的低聚糖浓度为５２．６ｇ／Ｌ，占总产物的３９．１９％；在亲水性乙酸乙酯／水（８０／２０，Ｖ／Ｖ）体系中得到低聚糖的浓度为４０．０４ｇ／Ｌ，占总产物的３９．６２％。另外，疏水性有机溶剂抑制低聚糖水解的能力强于亲水性溶剂。

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 p H分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn2 +、Fe3 +、Cu2 +抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β- D糖苷键具有高度专一性 ,与糖苷键相连的配基对酶活力也有很大影响。在 55℃ ,酶作用于底物 ONPG和乳糖的米氏常数 Km分别 2 .6 3mmol/L和 4 .93mmol/L,最大反应速度分别为 1.93× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein和 6 .54× 10 -5mmol.min-1.mg-1protein。乳糖的水解产物葡萄糖抑制酶活力 ,其抑制常数 2 .4 7mmol/L ,但半乳糖没有这种效应。另外 ,该酶具有转半乳糖苷的活力 ,在水解乳糖过程中 ,生成包括三、四糖的半乳糖低聚糖。

米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究

研究了反应时间、乳糖浓度、温度、加酶量、pH对低聚半乳糖合成的影响,结果表明,加酶量、乳糖浓度、反应温度的影响较大。通过正交实验确定的米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最佳工艺条件为:pH6.0、温度55℃、乳糖浓度40%、加酶量40U/g、反应时间32h。在最佳工艺条件下,低聚半乳糖的合成率为32.4%。

黑曲霉变种RM48 α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

经硫酸铵沉淀、疏水柱层析和分子筛层析,从黑曲霉变种RM48(Aspergillus niger v.Tiegh RM48)固体发酵后的浸提液中分离纯化了α-半乳糖苷酶.SDS-PAGE分析表明,此酶蛋白的分子量约为108kDa.酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度是60℃,耐热温度为40℃;最适反应pH为4.5,在pH3.0～6.0之间保持90%以上的酶活性;在实验的金属离子范围内,所有金属离子对黑曲霉变种RM48α-半乳糖苷酶均有抑制作用,其中Cu2+和Fe2+抑制作用最为显著,Li2+、Zn2+、Mn2+、K+、Na+、Ca2+、Mg2+和Co2+对酶活性有轻微的抑制作用.在pH4.0和60℃反应条件下此酶的Km为7.37mmol·L-1,Vmax为5618IU·mg-1·min-1.成熟酶蛋白N端序列为DEKAYSPCYY,与已报道的α-半乳糖苷酶蛋白无同源性.

超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A和B产生的β-半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β-半乳糖苷酶的活力。通过单因素试验和正交试验,选出了超声波破碎的最佳工艺条件。实验表明,嗜酸乳杆菌A在工作时间7.6min,工作/间歇为28s/20s,温度36℃时,超声波对细胞的破碎效果较好,此条件下破碎后,A株产生的β-半乳糖苷酶活力为5.963μmolONP/L·min。嗜酸乳杆菌B在工作时间6.8min,工作/间歇为20s/20s,温度37℃时效果较好,产生的β-半乳糖苷酶活力为6.683μmolONP/L·min。因此,嗜酸乳杆菌具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力。