酿酒酵母α-半乳糖苷酶基因重组菌株的表达分析

PCR扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)2个α-半乳糖苷酶基因agl2和agl3,将其分别与表达载体pY-ES2连接,电转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSc1菌株。从重组菌株提取载体进行单酶切凝胶电泳检测,证实agl2和agl3分别在重组菌株AGL2和AGL3表达。以葡萄糖和棉子糖为碳源培养菌株,2株重组菌的生长速率均显著高于原始菌株,提前8h菌数达到最大,其中以AGL3的生长速率提高较为明显,重组还使菌株在液体培养基由原来的部分絮凝转变为完全游离状。2株重组菌株均不能利用蜜二糖为碳源生长。

分枝犁头霉WL511热稳定α-半乳糖苷酶基因克隆及序列分析

构建并筛选耐热分枝犁头霉cDNA文库获得639 bp热稳定α-半乳糖苷酶基因片段,并以5′-RACE和3-′RACE技术获得上下游片段1817 bp和1092 bp,拼接得α-半乳糖苷酶全长序列2228 bp,其完整开放读码框为2142 bp,编码713个氨基酸,G+C含量43%;产物预测等电点5.2,预测相对分子质量81000。该基因(GenBank No.DQ234280)属α-半乳糖苷酶36家族,与其他来源的α-半乳糖苷酶基因同源性较低,与链霉菌Streptomyces avermitilis MA-4680的α-半乳糖苷酶同源性最高为38%。

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.

热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

克隆前期筛得分枝犁头霉Absidia ramosa WL511的热稳定α-半乳糖苷酶cDNA基因aga(GenBank No.DQ234280),将aga基因插入表达载体pPICZαA并电转化整合到毕赤酵母P.pastoris GS115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%(V/V)时,酵母发酵上清液中酶活达32U/ml。纯化后酶的比活力为137U/mg,SDS-PAGE显示单一条带,凝胶过滤和SDS-PAGE估算其分子量分别为348kDa和87kDa,该酶为四聚体结构,糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kDa。该酶等电点为5.2,最适反应温度73℃,最适pH6.8,60℃以下及pH5.5～9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活,85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-D-半乳糖苷为底物,该酶Km值为0.42mmol/Lol/L;Vmax为413U/mg;kcat为64531/min。

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。

α-半乳糖苷酶A基因敲除猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的 基于CRISPR/Cas9技术构建α-半乳糖苷酶A (GLA)基因敲除的巴马公猪胎儿成纤维细胞(PFFs),为构建人类Fabry病猪模型提供实验材料。方法 利用生物信息学方法对人/猪GLA基因编码的α-Gal A的相似性进行分析,并鉴定出猪α-Gal A的催化残基位置。通过在线工具在编码催化残基之前的外显子区设计单链向导RNA,构建CRISPR/Cas9打靶载体。将打靶载体与抗性质粒共转染至巴马公猪胎儿PFFs,用G418药物筛选出单克隆细胞,并PCR测序鉴定。结果 人/猪α-Gal A的氨基酸序列一致性为81%,相似性为89%;三维结构的均方根偏差值为0.012。猪α-Gal A的催化残基是第174位和第235位的天冬氨酸。成功构建CRISPR/Cas9打靶载体,并筛选出单克隆细胞,PCR测序鉴定其基因型。结论 用生物信息学方法验证了人/猪α-Gal A具有高度的相似性。利用CRISPR/Cas9技术获得了GLA基因敲除的巴马公猪PFFs细胞系,为构建人类Fabry病猪模型奠定了基础。

不同来源α-半乳糖苷酶对肉仔鸡生产性能及血液生化指标的影响

试验旨在研究微生物和转基因玉米两种来源的α-半乳糖苷酶对肉仔鸡生产性能以及血液理化指标的影响。选取648只1日龄AA肉仔鸡随机分为3组,每组12个重复,每个重复18只(公母各半)。1组饲喂添加90 U/kg微生物来源α-半乳糖苷酶的饲粮,2组饲喂α-半乳糖苷酶转基因玉米(酶活150 U/kg)替代50%亲本玉米,3组饲喂α-半乳糖苷酶转基因玉米替代100%亲本玉米的饲粮,试验期为6周。结果显示:各组间肉鸡日增重、采食量差异不显著(P>0.05),2组饲料报酬优于1组;2组和3组粪便中的棉籽糖、水苏糖含量显著低于1组(P<0.05);各组间肉鸡血液生化指标无显著区别。试验表明转基因玉米来源的α-半乳糖苷酶在改善肉鸡饲料报酬、降低粪便中棉籽糖和水苏糖含量效果优于微生物源α-半乳糖苷酶。

重组α-半乳糖苷酶酶解大豆低聚糖研究

本研究应用本实验室基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行了酶解,应用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)法检测了酶解前后大豆低聚糖的变化情况,结合大豆制品传统加工工艺,提出了酶的添加方式和工艺。

重组α-半乳糖苷酶消除大豆低聚糖引起的小鼠肠胃胀气的研究

目的:分析食用大豆及其制品中的低聚糖引起肠胃胀气的原因。基因重组α-半乳糖苷酶对棉籽糖和水苏糖进行酶解,低聚糖对小鼠肠胃胀气的缓解情况。方法:以棉籽糖和水苏糖标准品作为受试物,分别灌胃给予不同周龄的昆明种小鼠,分析棉籽糖和水苏糖是否引起小鼠肠胃胀气;通过测量小鼠胀肠容积的方法检测胀气情况;硅胶薄层层析(TLC)检测低聚糖;SDS-PAGE法检测大豆蛋白。结果:棉籽糖、水苏糖均能够引起小鼠肠胃胀气;基因重组α-半乳糖苷酶可以消除小鼠食用棉籽糖和水苏糖后的肠胃胀气现象,添加的α-半乳糖苷酶对大豆蛋白没有影响。结论:α-半乳糖苷酶可做为食品添加剂,用来解决食用豆制品时发生的肠胃胀气。

Fabry病一家系临床调查及α-半乳糖苷酶A基因突变研究

目的分析一个Fabry病家系先证者的临床表现,并进行该家系成员α-半乳糖苷酶A(GLA)基因突变检测。方法回顾性分析该家系先证者临床及病理资料,采用聚合酶链式反应(PCR)直接测序法检测先证者及家系成员GLA基因编码序列。结果①先证者表现为下肢皮肤色素沉着、神经性疼痛和肾脏损害,其弟死于尿毒症。肾活检提示继发性局灶节段性肾小球硬化,肾小球足细胞泡沫变性,电镜发现足细胞内大量同心圆排列的具有层状结构的包涵体,确诊Fabry病。②GLA基因测序检测发现1个无义突变,位于第2号外显子CAG119TAG(Q119T),终止密码提前出现致使形成一条截短的多肽链。家系发现2例杂合子,分别为先证者母亲及侄女。结论本研究从生化、病理及基因水平3个层面诊断了一个Fabry病家系,确诊致病原因为GLA基因点突变〔第2号外显子CAG119TAG(Q119T)〕,该突变在中国人群中首次报道。

14例Fabry病肾损害的临床、病理及基因突变特点的分析

目的探讨Fabry病肾损害的临床病理及α-半乳糖苷酶A（d—GalA）基因（GLA基因）突变的特点。方法回顾性分析14例Fabry病患者的临床、肾脏病理及GLA基因突变等特点。结果Fabry病肾损害在肾活检患者中检出率为0．074％，平均确诊年龄（30．57±9．32）岁，男：女=2．5：1。尿蛋白量中位数为1．71g／24h[（0．32～4．71）g／24h]。5例有血尿，4例有肾功能受损，肾外受累的表现以血管角质瘤最多见（10／14），其次为心脏病变（6／14）。经典型患者9例，迟发型5例，其中6例有肾脏病家族史。肾脏病理光镜下可见明显的肾小球细胞空泡变性，部分患者可见硬化的肾小球。电镜下2例女性患者为部分足细胞内有髓磷脂样小体形成，其余病例所有足细胞内均可见髓磷脂样小体。4例测定α-GalA活性的先证者均低于正常值。12例先证者进行了GLA基因突变分析，11例发现有GLA基因突变。3个新突变为碱基插入或缺失突变，临床表型均为经典型Fabry病。大多数迟发型患者携带的基因突变位于酶结构的包埋区或部分包埋区（3／11）。在已证实的GLA基因突变中，携带191T、R112H、Q312H的先证者主要表现为“迟发型”；携带W162X、F169S、S201F、N272K及L310R的先证者均表现为“经典型”。结论本组Fabry病肾损害患者占肾活检的0．074％，常伴有血管角质瘤及心脏受累，且不同的GLA基因突变可能与患者的表型密切相关。