普通烟草β-半乳糖苷酶基因(NtBGAL)的生信分析及其在不同组织及原核诱导的表达

【目的】探明普通烟草β-半乳糖苷酶基因NtBGAL的表达模式与蛋白特征,为后期创制烟草多用途利用的底盘材料提供依据。【方法】通过比对普通烟草K326基因序列与本氏烟草NbBGAL1基因的同源性,以K326的cDNA为模板经PCR技术克隆获得NtBGAL基因,随后利用生信工具软件分析其基因结构及蛋白理化性质,并采用qRT-PCR检测该基因在烟草不同组织部位(根、茎、叶和花)的表达模式,最后开展原核诱导表达、蛋白纯化及蛋白表征研究。【结果】克隆获得烟草NtBGAL基因,其与本氏烟草NbBGAL1基因同源性最高,二者具有相同的结构域(Motif);该基因定位于9号染色体上,含有18个内含子,mRNA长度为6649 bp,CDS长度为2541 bp,编码846个氨基酸,翻译的β-半乳糖苷酶属于GH35家族,NtBGAL蛋白的分子量为92.44 kDa,理论等电点(pI)为6.8,GRAVY为-0.222,定位于细胞壁。该基因在普通烟草不同组织部位的表达量为花>叶>茎>根,差异显著。在37℃下进行原核诱导,NtBGAL蛋白有明显表达;采用包涵体纯化方法获得较高纯度的NtBGAL蛋白。NtBGAL蛋白酶促反应最适温度为30~40℃,最适pH为4.0~6.5,Mn^(2+)浓度为0.05~0.15 mmol/L时对NtBGAL酶活性有增强作用。【结论】研究明确NtBGAL基因的组织表达模式及蛋白表征,为进一步通过改造NtBGAL基因,利用普通烟草生产人源化糖蛋白奠定基础。

园艺作物果实β-半乳糖苷酶研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶GH35家族,参与了植物不同生长阶段细胞壁的合成与修饰,尤其对肉质水果发育和成熟过程中多糖的裂解具有重要作用。文章概述了β-半乳糖苷酶的蛋白功能、不同亚型、亚细胞定位和活性规律,重点阐述了该基因家族在园艺作物果实质地变化中的作用及相关研究进展。

适冷β-半乳糖苷酶及其在食品工业中的应用

β-半乳糖苷酶,又称乳糖酶,广泛存在于细菌、真菌、酵母菌等微生物中,主要功能是乳糖水解和合成低聚半乳糖。利用β-半乳糖苷酶生产低乳糖牛奶等乳制品成为解决乳糖不耐受问题最有效的途径,然而常用的商业化β-半乳糖苷酶的最适反应温度大多较高,对pH的要求比较严格,存在生产成本较高、消耗能量高等问题。适冷β-半乳糖苷酶在低温下也具有较高的酶活性,广泛应用于食品行业中,尤其在乳品工业。在低温下水解乳糖,生产低乳糖或无乳糖乳制品,供乳糖不耐受者食用,可降低成本、节约能源,具有重要意义。该文综述了β-半乳糖苷酶的微生物来源、特性、催化特性的研究现状,对适冷β-半乳糖苷酶的来源、特性、耐冷机制及工业化应用进行了系统阐述,并对其前景进行了展望。

根癌农杆菌介导β-1,4-半乳糖苷转移酶基因转化大豆及其转基因植株再生

以大豆下胚轴为外植体 ,通过根癌农杆菌介导转化法 ,建立起良好的转化系统 ,将人的 β -1 ,4-半乳糖苷转移酶基因 (hGT)导入大豆。经转化的外植体在添加 1 0 0mg/L氨苄青霉素和 5 0mg/L卡那霉素的选择培养基中可诱导出愈伤组织和芽再生 ,在 1 /2MS培养基上诱导生根 ,并培养成再生苗 ,获得了完整的抗性再生植株。进行Southernblot分子杂交鉴定 。

耐热性α-半乳糖苷酶突变体的筛选及酶学性质研究

研究旨在改造株链球菌来源的α-半乳糖苷酶基因Gal_(2)7A,获得耐热性高的突变体。在常规PCR体系中加入不同水平的MnCl_(2),将基因克隆至载体pGAPZαA并成功构建表达酶产物的重组质粒pGAPZαA-Gal_(2)7A。将线性化的重组质粒电转至毕赤酵母GS115,在含有100 g/L博来霉素的YPDS平板上筛选耐热性提高的突变体,通过pNPG的方法测定重组酶的酶学性质为最适温度65℃,最适pH值6.5,Ag^(2+)、Hg^(2+)对重组酶的酶学活性具有明显的抑制作用,Cu^(2+)对重组酶的酶活性具有促进作用。研究表明,试验成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株29和54,在55℃保温10 min与同等条件下的野生型进行对比,加热前后的保留酶活比的增幅大于45%。

日粮添加α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪生长性能、养分消化率及血清免疫指标的影响

本试验将不同水平的α-半乳糖苷酶添加到断奶苏姜仔猪日粮中,研究对其生长性能、血清免疫指标和养分消化率的影响。试验将108只断奶苏姜仔猪平均分为4组,每组3个重复,每个重复9只仔猪,分别为对照组(喂养普通日粮)、试验Ι组(日粮+50U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅱ组(日粮+100U/kgα-半乳糖苷酶)、试验Ⅲ组(日粮+200U/kgα-半乳糖苷酶),试验期为40d。结果发现:与对照组相比,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪的末重、平均日增重及料重比均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶对提高断奶苏姜仔猪的生长性能效果最显著(P<0.05),断奶苏姜仔猪平均日增重比对照组提高了9.07%,料重比较对照组降低了8.82%;其次,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶对断奶苏姜仔猪血清中的IgA、IgG、IgM等免疫指标均有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组免疫指标与对照组相比差异最显著(P<0.05),IgA、IgG、IgM分别提高16.5%、21.6%和52.9%。最后,在日粮中添加不同水平的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的养分消化率也有显著影响(P<0.05),其中添加100U/kgα-半乳糖苷酶的试验组养分消化率与对照组相比差异最显著(P<0.05),粗纤维消化率和粗蛋白质消化率分别比对照组提高8.29%和8.02%。结果表明,在日粮中添加100U/kg的α-半乳糖苷酶,对断奶苏姜仔猪的生长促进效果最明显,可使断奶苏姜仔猪的饲料效率最佳。

β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用

β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用工程菌的异源表达系统生产β-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对β-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及β-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述,旨在为新型β-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。

β-半乳糖苷酶荧光探针的研究进展

β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶,在食品工业、基因工程、酶工程、蛋白质工程、生物医学等领域发挥着重要作用。β-半乳糖苷酶活性及含量的异常与癌症的发生发展密切相关,因此该酶检测对早期癌症诊断有着重要意义。传统酶活性检测方法具有一定的局限性,无法实现对β-半乳糖苷酶的原位无损检测。荧光探针因灵敏度高、选择性好、可用显微镜直接观察、分辨率高、响应时间短、操作方便、成本低等优点深受研究者青睐。在简述荧光探针设计原理的基础上,对近年来β-半乳糖苷酶荧光探针的设计合成研究进展进行了综述,阐述了β-半乳糖苷酶荧光探针在生物成像、早期癌症诊断等应用进展,为β-半乳糖苷酶高效检测技术的研究提供了帮助。

芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶的性质及其在合成低聚半乳糖中的应用

低聚半乳糖是一种重要的益生元,芽孢杆菌(Bacillales sp.)来源的β-半乳糖苷酶具有转半乳糖苷活性,能合成低聚半乳糖。研究了一个新的芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶的表达、酶学性质及其在合成低聚半乳糖中的应用。从芽孢杆菌中克隆了一个糖苷水解酶35家族的β-半乳糖苷酶基因(BABgal35A),并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。多重序列比对结果表明:BABgal35A与环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)来源的β-半乳糖苷酶同源性最高,为79.9%,是一个新型的β-半乳糖苷酶(命名为BABgal35A)。粗酶液经Ni-IDA亲和层析纯化得到电泳级纯酶,蛋白电泳分析表明其分子质量为60 kDa左右,最适pH值和温度分别为5.0和55℃,并且该酶在pH值为4.5~8.0,温度为20~45℃时稳定性好。BABgal35A对o NP-β-galactopyranoside具有较高的催化活性。该酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖的产率达34%。研究结果表明,芽孢杆菌35家族β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖的制备中具有潜在的应用价值。

多粘类芽孢杆菌适冷性新型β-半乳糖苷酶的重组表达和酶学性质

目的:本实验旨在挖掘一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,为低温生产低乳糖乳制品或合成低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)提供基础。方法:从多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)基因组中克隆一个β-半乳糖苷酶(PpBgal42A)基因,构建重组表达质粒pET-28a-PpBgal42A在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经亲和层析纯化后研究重组β-半乳糖苷酶的酶学性质,利用高效液相色谱检测各糖分浓度,以GOS转化率为指标,评价PpBgal42A的转糖苷能力。结果:PpBgal42A与酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)来源的糖苷水解酶42家族β-半乳糖苷酶同源性最高,为59.9%。纯化后,PpBgal42A的比活力为163.7 U/mg,分子量约为79 kDa。其最适pH和温度分别为pH7.5和35℃,在pH7.0~9.5范围内和4~35℃以下保持稳定,50℃时快速失活,35℃时的半衰期为1777 min。PpBgal42A利用350 g/L乳糖于30℃反应6 h后合成GOS的转化率为31.6%。结论:PpBgal42A是一个适冷性新型β-半乳糖苷酶,可水解乳糖并合成低聚半乳糖,具有潜在应用价值。

生物合成α-半乳糖苷酶的研究进展

α-半乳糖苷酶是一种外切糖苷酶,可用于改善和消除饲料及豆制食品中的抗营养因子,良好的生物催化能力使其在食品、饲料和医药等领域显示出巨大潜力,但目前α-半乳糖苷酶的微生物发酵产量及活性并不高。该文在阐述α-半乳糖苷酶的催化机制的基础上,对α-半乳糖苷酶的微生物来源,产α-半乳糖苷酶菌株的发酵以及该酶的异源表达和分离纯化进行了综述,并对开发低成本、高活性和高产量的α-半乳糖苷酶生产工艺进行展望,以期显著提高α-半乳糖苷酶的生产水平,为后续对α-半乳糖苷酶的产业化研究奠定基础。

β-半乳糖苷酶基因(lacZ)在海藻裙带菜中的稳定表达

借鉴海带遗传转化模式 ,利用基因枪法将 β 半乳糖苷酶基因 (lacZ)导入裙带菜雄配子体中 ,一部分诱导形成营养增殖的丝状体 ,另一部分和雌配子体受精生成孢子体。五个月后组织化学染色结果表明 5 %的孢子体个体和 30 %的丝状体细胞表现了lacZ的稳定表达 ,利用PCR和PCR Southern检测得到了预期的阳性信号。本文结果提示了利用基因枪转化方法 。

海栖热袍菌耐高温β-半乳糖苷酶基因的克隆和表达

本文主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8的一个β-半乳糖苷酶基因(TM_0310)。以海栖热袍菌基因组DNA(GenBank登录号AE000512)为模板,设计特异性引物带有NcoI-HindIII酶切位点,克隆得到的该基因全序列为2019bp,编码672个氨基酸,分子量为78.972kD。该基因编码的蛋白质属于42族,根据氨基酸同源性分析,该β-半乳糖苷酶与Thermotoga petrophila RKU-1来源的假想的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号ABQ46628.1)以及Thermotoga sp.RQ2来源的β-半乳糖苷酶(GenBank登录号EDQ29256.1)同源性最高,均为95%。重组转化子经诱导酶比活可达2.08U/mg蛋白。粗酶液经过80℃热处理10min,酶活残留70%以上,表明该酶有很好的耐热性,在高温工业环境中有良好应用前景。

香蕉果实软化相关β-半乳糖苷酶基因的克隆及其表达分析(英文)

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)通过分解细胞壁半纤维素切除半乳糖键而参与果实软化。为了阐明香蕉(Musasp.)果实成熟过程中的软化与细胞壁代谢酶β-半乳糖苷酶基因表达之间的关系,采用RT-PCR方法,从成熟香蕉果实果肉中分离了编码β-半乳糖苷酶基因的部分cDNA(MA-Gal),序列分析表明,MA-Gal包含927bp,编码309个氨基酸,包含5 个β-半乳糖苷酶结构域(典型真核生物中β-半乳糖苷酶包含7 个结构域),推导的MA-Gal 蛋白质中有β-半乳糖苷酶蛋白的催化活性部位GGPIILSQIENEY(F);系统进化树分析结果表明MA-Gal属于第一类β-半乳糖苷酶基因(该类主要在果实中表达);β-半乳糖苷酶活性和硬度的变化表明其与香蕉果实硬度变化密切相关;Northern 分析显示,跃变前期的果肉中,MA-Gal 基因的表达量很低,后随着果实的软化表达量不断增加,并在呼吸跃变后达到最高。所有结果表明,MA-Gal 参与香蕉果实成熟过程中的软化。

原核基因工程制备新型重组α-半乳糖苷酶应用于人B→O血型改造的研究

本研究利用基因工程方法制备脆弱类杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶并将其应用于人B→O血型改造。在获得了能够表达细菌α-半乳糖苷酶工程菌株的基础上,从诱导时间、诱导剂浓度两个方面对工程菌株的诱导条件进行优化,获得细菌α-半乳糖苷酶的最佳可溶性表达条件;超声上清经过阳离子交换层析和阴离子交换层析等方法进行纯化。利用纯化后的α-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中处理B型红细胞2小时,制备O型红细胞。结果表明细菌α-半乳糖苷酶最佳诱导表达条件为:37℃、起始D600为0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为2小时。纯化后α-半乳糖苷酶的纯度为电泳纯,比活由纯化前的0.42 U/mg提高到了2.1 U/mg。该酶在26℃、接近中性的pH条件(6.8)下经2小时可将B型红细胞改造成O型红细胞,需要的酶量为225μg/ml红细胞。结论:建立了重组细菌α-半乳糖苷酶的表达纯化工艺,制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞,为B→O血型改造提供了更有效的工具酶。

苦瓜果实β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与β-Gal基因相关的EST序列,采用经3'RACE技术,克隆获得1个苦瓜β-Gal基因的cDNA序列McGAL,全长为2261 bp,开放阅读框2160 bp,编码719个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为AFD54987.1。应用生物信息学软件对McGAL氨基酸序列分析表明,McGAL含有糖苷水解酶家族35的保守结构域G-G-P-[LIVM]-x-Q-x-E-N-E-[FY],C端不含凝集素结构域。二级结构显示,该酶含有α-螺旋(19.89%)、伸展链(26.98%)、β-转角(6.54%)和无规卷曲(46.59%)。McGAL氨基酸序列与鹰嘴豆、苜蓿、绿豆、大豆、羽扇豆的氨基酸序列的同源性分别达到73%、73%、73%、72%和71%。亚细胞定位结果表明,McGAL定位在线粒体膜上。荧光定量结果表明,McGAL在果实绿熟期表达量最高并随之下降,该基因可能与果实成熟软化初期相关。

香蕉果实β-半乳糖苷酶基因cDNA克隆及序列分析

利用已报道β-半乳糖苷酶基因(-βga lactos idase)的保守序列设计简并引物,进行RT-PCR,从香蕉果实中得到900 bp左右的一个片段,命名为M A-ga l,序列分析表明M A-ga l全长927 bp,编码309个氨基酸,具有所有β-半乳糖苷酶基因共有的活性催化部位GGP IILSQ IENEY(F);M A-ga l片段的氨基酸序列与芦笋、草莓、番茄、芒果及鳄梨等果实相应基因的相似性分别为85.8%、80.9%、80.5%、79.1%和76.3%.

马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶合成条件的优化及其酶学性质表征

β-半乳糖苷酶是广泛使用的食品添加剂,主要用于降解乳制品中的乳糖,缓解乳糖不耐受症状。该研究对实验室保藏菌株马克斯克鲁维酵母的发酵条件进行了优化。在20 g/L半乳糖、20 g/L玉米浆干粉、40℃、初始pH 6.5、150 r/min的条件下,粗酶液的酶活力为26.3 U/mL,表明该菌株具有利用廉价碳氮源高效生产β-半乳糖苷酶的潜力。通过DEAE阴离子交换层析进一步纯化得到比活力为124.09 U/mg的纯化酶。纯化后酶的最适温度40℃,最适pH 6,Km为5.28 mmol/L,kcat为4.74 s^(-1)。此外,发现该酶受Mg^(2+)的促进,在20~40℃表现出优异的热稳定性,40℃下30 min仍能保持95.6%的活力。因此,马克斯克鲁维酵母β-半乳糖苷酶比乳酸克鲁维酵母的热稳定性更好,具有潜在的工业应用潜力。

苹果果实β-半乳糖苷酶基因启动子的克隆与功能分析

根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物,克隆得到苹果品种‘嘎拉’中β-半乳糖苷酶基因(Md-gal)的启动子。序列分析表明,该启动子除含有大多数高等植物启动子具有的保守元件外,还含有大量光响应元件和与激素相关的顺式作用元件,主要有赤霉素响应元件(GARE-motif和P-box)、茉莉酸甲酯(MeJA)应答元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和生长素响应元件(TGA-element);构建5个不同长度Md-gal启动子和GUS基因融合的瞬时表达载体,并进行苹果果实和烟草叶片转化试验,结果显示,5个启动子均具有启动子活性,在Md-gal启动子序列中激活与抑制调节元件并存,正调控元件位于-1206^-754bp区域,负调控元件位于-754^-597bp区域;对Md-gal启动子进行激素响应分析结果显示,激素处理可对其产生诱导作用,且MeJA处理后GUS活性最高。研究表明,Md-gal启动子具有真核基因启动子的基本结构特征和正负调控特性,可响应外源激素处理,可能在苹果果实生长发育和成熟软化方面具有一定的作用。

重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定

目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。