流感病毒RNA碱性聚合酶-2抑制剂研究进展

季节流行性感冒是一种易在人际传播的急性病毒感染,是目前对人类健康构成威胁的主要呼吸道传染病之一。迄今为止,流感的预防和治疗主要采用接种疫苗预防和开发抗病毒药物防治并重的应对手段。目前临床应用的抗流感病毒药物包括基质蛋白-2抑制剂(如金刚烷胺)、神经氨酸酶抑制剂(如奥司他韦)、内切酶抑制剂(如巴洛沙韦酯)和聚合酶抑制剂(如法匹拉韦)等,均已产生广泛耐药性。研究开发机制新颖的、与现有药物没有交叉耐药的抗流感病毒药物是解决季节流行性感冒治疗这一尚未完全解决的医学问题,以及应对流感大规模爆发的有效手段。流感病毒RNA碱性聚合酶-2(PB2),由于其在不同流感病毒间的高度保守性而不易产生耐药性,使其成为一个非常有吸引力的药物靶点。目前PB2抑制剂的研究开发已成为抗流感病毒药物的一个热点,特别是围绕明星分子吡莫地韦及其类似物的研究吸引了极大的关注,虽然吡莫地韦因疗效不理想最终止步于Ⅲ期临床试验,但是在其研究过程中所揭示出的PB2蛋白与小分子结合模式及构效关系,为进一步开发该类药物奠定了扎实的基础。本文主要针对PB2抑制剂近10年相关药物化学的研究进展进行综述,并对该药物研究领域的前景提出展望。

LncRNA GAS5通过TIMP-3启动子甲基化促进软骨胶原蛋白降解的实验研究

目的骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一种常见的关节疾病,可由内源性和表观遗传因素引起。软骨退变可恶化为OA。本研究旨在探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)GAS5在OA中的基本机制。方法14例正常膝关节软骨组织取自2018年7月至2020年7月因胫骨平台骨折在复旦大学附属中山医院吴淞医院行骨折内固定的患者,男8例,女6例;年龄19~40岁,平均(31±5)岁。35例OA膝关节软骨组织取自2018年7月至2020年7月在复旦大学附属中山医院吴淞医院就诊,诊断为OA且有膝关节置换手术指征的患者,男17例,女18例;年龄62~86岁,平均年龄(70±4)岁。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-3 mRNA的表达情况。使用白细胞介素(interleukin,IL)-1β(10 ng/mL)建立OA细胞模型,分析OA基因芯片GSE16464。RT-qPCR和western-blot检测软骨分解代谢抑制因子TIMP-3的表达。用芯片定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测TIMP-3启动子区富集的CpG岛情况。用生物信息学方法预测GAS5与TIMP-3的靶向关系,并用双荧光素酶报告基因检测法进行验证。结果在OA患者组织中TIMP-3 mRNA表达显著低于正常软骨组织,OA患者组与正常软骨组织软骨细胞TIMP-3启动子区甲基化阳性率分别为72.1%和35.7%。LncRNAGAS5在OA中高表达,LncRNAGAS5在OA中表达较正常软骨组织中表达明显上调(P<0.05)。Blast序列比对GAS5序列与TIMP-3启动子序列具有结合位点。沉默LncRNA GAS5促进TIMP-3表达,抑制OA软骨细胞胶原降解。双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与TIMP-3具有靶向调控关系。结论OA软骨组织中TIMP-3低表达,而LncRNA GAS5表达上调;LncRNA GAS5可富集DNA甲基化转移酶,抑制TIMP-3的表达,促进软骨细胞胶原蛋白降解。

克里米亚-刚果出血热病毒反向遗传学系统的开发及应用

克里米亚-刚果出血热正内罗病毒(CCHFV)是引发烈性传染病克里米亚-刚果出血热的病原体。由于CCHFV基因组为3节段负链RNA,且最大的节段长达12 kb,操作难度极大,因此其反向遗传学系统的发展较为缓慢,直至2015年才成功构建了基于质粒的全病毒拯救系统。本文就克里米亚-刚果出血热正内罗病毒反向遗传学系统的研究进展及应用做简要综述。

抗病毒天然产物Glaucogenin C前体化合物的合成

以巴豆酸乙酯为原料,通过六步反应合成了Glaucogenin C中B环的重要前体化合物——3-[2-(对甲氧基苯甲醚)-3-甲基-4-环己酮-1-羰基]-4-异丙基-2-噁唑啉酮,总产率30.5%,其结构经1H NMR确证。

卡格列净通过抑制长链非编码RNA CO9缓解高糖环境下肾小管上皮细胞凋亡

目的探讨高糖环境下卡格列净通过抑制lncRNA CO9缓解肾小管上皮细胞凋亡的作用及其机制。方法体外培养人近端肾小管上皮细胞系(HK-2),将其分为正常葡萄糖(NG)组、高渗(HO)组、高糖(HG)组、高糖+二甲基亚砜组(DMSO组)、高糖+卡格列净组(CANA组)、高糖+阴性对照小干扰RNA组(si-NC组)、高糖+lncRNA CO9小干扰RNA组(si-CO9组)、高糖+空载质粒组(PEX-NC组)、高糖+lncRNA CO9过表达质粒组(PEX-CO9组)、高糖+卡格列净+lncRNA CO9过表达质粒组(CANA+PEX-CO9组)。采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法与四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖率;Western blotting检测凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、活化型Caspase-3]与核因子(NF)-κB p50亚基及其前体p105蛋白的相对表达量,计算Bax/Bcl2蛋白相对表达量比值;流式细胞术检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA CO9与NF-κB1 mRNA的相对表达量。采用荧光原位杂交检测lncRNA CO9亚细胞定位,基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析预测其功能。收集临床正常对照组(NC组,5例)与糖尿病肾脏病组患者(DKD组,5例)肾脏样本,检测其近端肾小管上皮细胞lncRNA CO9的表达。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果与NG组相比,HG组细胞增殖率降低,Bax/Bcl2蛋白相对表达量比值、Caspase-3与活化型Caspase-3蛋白相对表达量、细胞凋亡率、lncRNA CO9均显著上调;而与HG组相比,CANA组细胞凋亡率下降,lncRNA CO9表达下调(P<0.05)。lncRNA CO9定位于细胞质。GO与KEGG分析显示,lncRNA CO9与细胞凋亡通路相关。在DKD组肾脏组织近端肾小管上皮细胞lncRNA CO9表达较NC组上调(P<0.05)。相较于HG组,si-CO9组凋亡蛋白相对表达量、凋亡率及NF-κB1 mRNA、NF-κB p50亚基及其前体p105蛋白相对表达量下降,PEX-CO9组则增高(P<0.05)。与CANA组相比,CANA+PEX-CO9组的凋亡蛋白相对表达量、凋亡率与NF-κB1 mRNA、NF-κB p50亚基及其前体p105蛋白相对表达量上升(P<0.05)。结论卡格列净可通过抑制lncRNA CO9的表达缓解高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。

猪繁殖与呼吸综合征的流行、诊断与防制

1病原猪繁殖与呼吸综合征又被称为蓝耳病,主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种免疫抑制性传染性疾病。该病毒属于套式病毒目动脉炎病毒科,是一种正链RNA病毒,直径约为50~70纳米,有囊膜。猪繁殖与呼吸综合征病毒包括欧洲型和美洲型。因为病毒出现基因变异、病毒基因重组以及基因突变等,导致猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因变异较大,尤其是一些毒株的抗原性和毒力存在较大的差异。从当前我国发现的猪繁殖与呼吸综合征病毒的存在情况来看,主要为美洲型。

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒DNA聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨TP的生物学功能.方法酵母双杂交相关实验材料购自美国Clontech公司,其中pACT2为人肝配合表达的cDNA文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为HLA024AH.pGBKT7-53和pGADT7-T中的p53和大T抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam中的Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照.含有AF384372 HBV DNA P全基因组cDNA的质粒G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存.TP基因的上下游引物序列分别为:5'-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTTA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶EcoRI和BamHI的酶切位点.引物合成及DNA测序由上海博亚公司完成.用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TP片段,连接人酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞AH109并在其内表达,挑取在SD/-Trp培养基上的转化子-即pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×109个细胞/ml),与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187配合,生长6～18 d后把长出的＞2 mm的酵母集落,在铺有X-α-gal的QDO培养基上检查α-gal活性,蓝色菌落为真阳性集落.挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的SOB平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序.提交GenBank分析.结果成功得到47个与TP特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein).筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP糖基转移酶1家族多肽A9;CD14抗原;β糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素E亚基;Z蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆RP11-107P7;RNA聚合酶Ⅱ亚单位hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白L链.19个假设蛋白的同源性在97%～100%.结论TP蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能.

超级增强子在肿瘤转移中的作用机制研究进展

超级增强子(SEs)是由基因启动子上游或下游附近的一大簇活性增强子组成,是维持肿瘤细胞特性所必需的。SEs的改变可引起肿瘤细胞转录程序的失调,导致肿瘤细胞高度依赖于SEs驱动的转录,形成“转录成瘾性”。肿瘤转移是肿瘤患者死亡的主要原因,已有研究表明SEs通过影响长链非编码RNA、肿瘤微环境、上皮-间质转化、肿瘤干细胞等调控肿瘤转移过程。本文总结了SEs的特点、功能及其与肿瘤转移的关系,以及针对SEs驱动的基因转录抑制剂,以期为SEs调控肿瘤转移的相关机制提供参考,为癌症转移患者的诊断、治疗提供新的视角。

森林脑炎(蜱传脑炎)

“动物源性感染性疾病”系指传染源和/或传播媒介为野生或圈养动物(包括兽类、畜类及鸟类等)的感染性疾病,多名以“人兽共患病”。其实,家畜和宠物不是野兽,鸟类更不属兽,故冠名欠实。“动物源性疾病”一词易误解为仅指传染源为动物的疾病,涵盖不全。“自然疫源性疾病”系以“自然疫源地学说”为依据的术语,广义适用,但依本义则对包括家畜家禽仍嫌费解。人和其它动物以及微生物都是“地球村”的“居民”。在相互依存的生活与进化过程中,关系不断演变,敌友不时转化,有时转益为害,有时变害为利;有的致病微生物毒力由强变弱,有的则由弱变强,还有的可能从无变有。研究如何将这种转化诱导变为有益于人,或于易感生物与寄生微生物彼此互利,必然是人类现实迫切而又长远艰巨的任务。候鸟飞禽扩大了疫区的范围,现代交通工具缩短了人员和物产的流动时间。这一局面,无疑增加了我们对此类疾病进行监测控制的困难。因此,加深对动物源性感染性疾病的认识,提高对其监控策略措施的贯彻力度,是当前紧迫的课题。本专辑选译自《日本臨》杂志2005年第63卷第12期,“動物由ウイルス感染症”专辑,由哈尔滨医科大学附属第二医院姚桢教授审校。