人组蛋白α-氨基乙酰基转移酶Nat11表达纯化、晶体生长及底物结合研究

α-氨基乙酰基转移酶11(Nat11)催化组蛋白H4和H2A氨基端乙酰化修饰,发挥着重要的表观遗传调控功能。将人Nat11基因构建到原核表达载体p SUMO中,转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行重组表达。通过镍柱亲和层析等一系列体外纯化步骤,获得高纯度Nat11。利用等温滴定量热法(ITC),测得Nat11与底物多肽微摩尔量级结合常数。利用质谱技术,发现纯化后的Nat11结合有大肠杆菌内源产生的乙酰辅酶A或辅酶A,在ITC滴定过程中可以产生对多肽底物的乙酰化修饰,表明纯化获得的Nat11在溶液中具有酶活力。随后,对Nat11进行晶体生长研究,通过初筛优化获得蛋白截短体及底物-酶融合蛋白单晶。

miR-485-5p靶向氧连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭

前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤。尽管采用雄激素剥夺疗法等策略在一定程度上对治疗前列腺癌有效,但大多数患者最终会进展为临床尚无有效治疗手段的去势抵抗性前列腺癌。因此,寻找新的更加有效的前列腺癌治疗靶点就显得尤为关键。多项研究表明,微RNA(microRNAs,miRNAs)的异常表达与肿瘤的发生相关。已有报道显示,miRNA-485-5p(miR-485-5p)在多种肿瘤中发挥抑癌作用,但其在前列腺癌中的作用在较大程度上仍未可知。本研究旨在探究miR-485-5p在前列腺癌细胞增殖、迁移与侵袭的作用与机制。生物信息学预测和qRT-PCR检测发现,miR-485-5p在前列腺癌中表达下调。平板克隆形成实验、Transwell实验和划痕愈合实验证明,转染miR-485-5p模拟物显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。生物信息学预测、双荧光素酶报告法、Western印迹和qRT-PCR检测证实,氧连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase,OGT)是miR-485-5p的一个下游直接靶标。进一步的分析和检测显示,OGT在前列腺癌中呈高表达,转染OGT的siRNA能够显著抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭,同时有效逆转转染miR-485-5p抑制物所发挥的促癌作用。综上所述,miR-485-5p可以通过负向调控OGT进而抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭。本研究结果有助于进一步阐释miR-485-5p在前列腺癌中发生发展的作用和机制,可为寻找前列腺癌的治疗靶点提供实验依据。

天冬氨酸氨基转移酶与血小板比值指数与纤维化-4指数对肝癌切除术后患者预后的预测价值

目的探讨肝硬化血液生化指标天冬氨酸氨基转移酶与血小板比值指数(APRI)、纤维化-4指数(FIB-4)对肝癌切除术后患者预后的预测价值。方法回顾性收集2005年2月至2017年7月在复旦大学附属中山医院行肝癌根治性切除300例患者的临床病理资料、肝癌复发和生存情况,分析APRI、FIB-4与肝癌患者术后复发、生存的关系,应用ROC曲线评价APRI、FIB-4对肝癌切除术后患者预后的预测价值。结果300例患者的中位随访时间为61个月。单因素Cox回归分析显示,APRI、FIB-4、血管侵犯是影响肝癌患者术后无复发生存期(DFS)、总生存期(OS)的危险因素;多因素Cox回归分析显示,血管侵犯是影响肝癌患者术后DFS(HR=1.518,95%CI 1.024~2.252,P=0.038)、OS(HR=2.301,95%CI 1.270~4.167,P=0.006)的独立危险因素。时间依赖ROC(time-ROC)结果显示,APRI、FIB-4预测术后1年、3年和5年DFS的曲线下面积(AUC)为0.555~0.596,预测术后1年、3年和5年OS的AUC为0.600~0.679。结论基于血液生化检测的肝硬化指标APRI与FIB-4对肝癌患者术后预后的预测价值有限。

大鼠海马和额叶皮层褪黑素限速酶N-乙酰基转移酶表达与年龄的关系

目的 观察从胚胎期到老年期大鼠海马和额叶皮层中褪黑素 (Melatonin ,MT)合成限速酶N 乙酰基转移酶 (ArylalkylamineN acetyltransferase ,AANAT)表达的变化特点。方法 ①引物设计 ,②RT PCR方法 ,③酶联法。结果 ①大鼠额叶皮层和海马中AANAT在胚胎和幼年期表达较高 ,成年后有一定下降。②在老年大鼠 ,海马中AANATmRNA明显降低甚至消失。③大鼠额叶皮层和海马中褪黑素水平在胚胎和幼年期较高 ,老年大鼠海马中褪黑素水平降至最低。结论 胚胎期额叶皮层AANAT有较高的表达 ,生后 3周～18月组降低 ,而老年大鼠海马中AANAT表达的降低和消失 ,可能是老化时中枢神经系统褪黑素水平下降的原因之一。

血清丙氨酸氨基转移酶及γ-谷氨酰基转移酶水平与2型糖尿病的关系

目的探讨丙氨酸氨基转移酶(ALT)及γ-谷氨酰基转移酶(GGT)与2型糖尿病(T2DM)的关系,为T2DM的早期预防提供依据。方法选取参加健康体检并填写调查问卷的2 597名体检者,根据血清ALT或GGT水平分别进行四分位分组(由低到高依次为Q1组、Q2组、Q3组和Q4组),采用Logistic回归分析评估ALT和GGT不同水平与T2DM患病风险的关系。结果随着ALT或GGT水平的升高,体重指数(BMI)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、血糖(Glu)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平及高血压患病率均逐渐升高(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均逐渐降低(P<0.001)。在调整了相关混杂因素(年龄、性别、吸烟、饮酒、锻炼、糖尿病家族史、BMI、TG、TC、HDL-C、LDL-C和高血压)后,ALT Q4组的T2DM患病风险是Q1组的1.70倍[比值比(OR)=1.70,95%可信区间(CI)1.05~2.73],GGT Q4组的T2DM患者风险是Q1组的2.38倍(OR=2.38,95%CI 1.77~3.17)。结论血清ALT和GGT水平与T2DM患病风险有关。

两步酶法制备去乙酰基7-氨基头孢烯酸

以生产头孢菌素C(CPC)过程中的副产物去乙酰头孢菌素C(DCPC)为原料,用固定化D-氨基酸氧化酶(DAAO)和固定化戊二酰基酰化酶(GA),连续两步进行酶裂解,制备了去乙酰基7-氨基头孢烯酸(D-7-ACA),总收率72%。滴加浓度为1 mol/L的过氧化氢可使去乙酰基戊二酰基7-ACA(D-G l-7-ACA)的收率提高6%。提高氧气流速和改善搅拌形式可以加快DAAO酶反应速度,使中间产物残留减少3%。高纯度的去乙酰头孢菌素C钠盐(DCPCNa)可以提高该两步酶法反应的收率和产品质量,延长酶的使用寿命。

4-氨基-1-羟基-2-氧-1,8-萘啶-3-甲酰胺类化合物抑制HIV整合酶链转移活性的主要微观结构因素探究

以25个4-氨基-1-羟基-2-氧-1,8-萘啶-3-甲酰胺类化合物为研究对象,利用遗传函数逼近法(GFA)构建了10个二维定量构效关系(2D-QSAR)模型,从中选取最优模型并检验其预测可靠性,并分析4-氨基-1-羟基-2-氧-1,8-萘啶-3-甲酰胺类化合物抑制HIV整合酶链转移活性的主要微观结构因素。结果表明,最优2D-QSAR模型的R^(2)=0.7776、Q^(2)=0.6421、r^(2)=0.87、(r^(2)-r′02)/r^(2)=0.01、k′=0.97、r^(2)_(m)=0.58,具有较高的稳定性和外部预测能力;热力学描述符AlogP、电拓扑状态描述符ES_Sum_sssN、ES_Sum_ssCH 2和空间描述符Shadow_nu是影响4-氨基-1-羟基-2-氧-1,8-萘啶-3-甲酰胺类化合物抑制HIV整合酶链转移活性的主要微观结构因素,其中Shadow_nu是最重要的微观结构因素。

心肺复苏后大鼠脑组织精脒/精胺-N1-乙酰基转移酶2与HIF-1α表达的动态变化规律

目的研究心肺复苏后大鼠脑组织中精脒/精胺-N1-乙酰基转移酶2(spermidine/spermine-N1-acetyltrans-ferase2,SSAT2)与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)表达的动态变化规律,分析二者相关性。方法 88只成年SD大鼠随机数字表法分为正常对照组(n=8)、假手术组(n=40)和心肺复苏组(n=40)。其中假手术组和心肺复苏组再分为1、8、24、48、72 h 5个亚组,每亚组8只。采用RT-PCR、Western blot法分别检测脑组织中HIF-1αmRNA和HIF-1α、SSAT2蛋白的表达。结果 SSAT2的表达在复苏后明显降低,1 h[(0.314±0.027),P<0.01]表达最低,随后逐渐升高(P<0.01),至72 h[(0.731±0.024),P>0.05]时回升到正常对照组水平(0.736±0.02),而假手术组SSAT2的表达与正常对照组相比无显著变化(P>0.05)。HIF-1αmRNA的表达在复苏后1 h[(0.245±0.021),P<0.05]时降低,但8 h[(0.430±0.019),P<0.05]时明显增强,后24 h[(0.387±0.018),P<0.05]、48 h[(0.385±0.019),P<0.05]下降,至72 h时回落到正常对照组水平(0.343±0.022);但HIF-1α蛋白在复苏后1 h[(0.755±0.012),P<0.01]显著增高,随后逐渐下降(P<0.01),至72 h[(0.033±0.002),P<0.01]时仅轻度增高,而在正常对照组和假手术组未能检测出HIF-1α表达。SSAT2表达与HIF-1α表达在复苏后72 h内呈负性相关(r=-0.945,P<0.01),SSAT2表达与HIF-1αmRNA表达在复苏后8～48 h呈负相关(r=-0.614,P=0.01)。结论在心肺复苏后一定时间内,大鼠脑组织SSAT2表达减弱,HIF-1αmRNA及蛋白表达增加,两者呈负相关表达,提示SSAT2对HIF-1α蛋白、HIF-1αmRNA可能起负性调节作用。

大肠杆菌N~α-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原N末端乙酰化修饰的影响

目的:研究大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI对人胸腺素α原(ProTα)N末端乙酰化修饰的影响。方法:在大肠杆菌中共表达ProTα与大肠杆菌Nα-乙酰基转移酶RimI,同时设置只表达ProTα的对照菌,分别提取纯化ProTα,利用HPLC检测其发生乙酰化修饰的程度。结果:ProTα的乙酰化修饰发生在翻译后水平,有无RimI的过表达、诱导时间的长短以及这两个因素之间的交叉效应均对ProTα的乙酰化程度有影响,其F值分别为53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;无论有无RimI过表达,乙酰化的ProTα所占比例在诱导6 h后逐渐升高(P<0.0001);在过表达Ri-mI的菌株中,乙酰化的ProTα在诱导12 h后占37.4%,而在无RimI过表达的菌株中占64.3%;RimI对ProTα乙酰化的抑制作用从诱导6 h后开始显现(P=0.0007)。结论:在大肠杆菌中,过量的Nα-乙酰基转移酶RimI可抑制人胸腺素α原的乙酰化修饰。

5-aza-2′脱氧胞啶联合组蛋白乙酰基转移酶抑制剂LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用

研究5-杂氮-2'-脱氧胞啶(5aza-CdR)联合组蛋白乙酰基转移酶(HDAC)抑制剂LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用。体外培养人尤文氏瘤细胞株RD-ES,观察不同浓度5aza-CdR联合HDAC抑制剂LAQ对RD-ES细胞的生长抑制作用。本实验表明HDAC抑制剂能增强5aza-CdR对RD-ES细胞抑制作用,且呈量-效关系,LAQ对RD-ES细胞系的IC50值是8 ng/mL,5aza-CdR联合LAQ对体外RD-ES细胞的抑制作用显著,并与瘤抑制基因ECAD和TSLC1的表达密切相关。5-az,a-2'脱氧胞啶联合HDAC抑制剂LAQ对RD-ES细胞生长有明显的抑制作用。

过表达组蛋白去乙酰基酶11抑制基底样乳腺癌细胞的侵袭和转移（英文）

目的研究组蛋白去乙酰基酶11(HDAC11)在基底样乳腺癌(BLBC)细胞侵袭和转移中的调控作用。方法利用GEO和TCGA数据库分析了HDAC11在BLBC中的表达,并用Transwell实验和裸鼠模型研究HDAC11对BLBC细胞侵袭和转移的影响。使用免疫共沉淀的方法观察HDAC11与Twist蛋白的相互结合,用启动子报告基因和染色体免疫共沉淀的方法鉴定HAS2是否为Twist的靶基因。结果与其他乳腺癌亚型相比,HDAC11在基底样乳腺癌中的表达较低。在BLBC细胞中过表达HDAC11可以强烈抑制BLBC细胞的体外迁移、侵袭和在裸鼠体内转移。HDAC11识别并占据Twist蛋白的DNA结合域,对抗其促侵袭的功能,并抑制Twist诱导的HAS2基因转录。结论 HDAC11过表达可抑制BLBC细胞的侵袭和转移。

N-乙酰基转移酶2(NAT-2)基因型与表型分析

目的:分析炎症性肠病(IBD)患者NAT-2基因型与表型,并探讨两者之间的一致性。方法:71例IBD患者提取DNA,用PCR-RFLP法分析基因型,随机选取20名IBD患者,通过服用磺胺二甲嘧啶,测尿中代谢物的吸光光度值,用比色法确定表型。结论:NAT-2基因型与表型结果吻合率高,基因型可预测表型。

人精胺/精眯N^1-乙酰基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鼠抗人精胺/精眯N1-乙酰基转移酶(SSAT)单克隆抗体,分析该抗体的效价、抗原特异性及其在Western blot和免疫组织化学等分析技术中的可用性。方法在BL21(DE3)中原核表达带6×His标签的SSAT重组蛋白,并用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。用SSAT重组蛋白免疫Balb/C小鼠,通过杂交瘤技术制备抗SSAT单克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用ELISA、Western blot及免疫组织化学技术检测。结果成功建立了稳定分泌鼠抗人SSAT的单克隆抗体杂交瘤细胞株,该单克隆抗体可用于ELISA、Western blot、免疫组织化学、免疫荧光等分析技术。结论成功制备SSAT单克隆抗体,为SSAT相关的分子和病理研究奠定了基础。

N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸调节α-微管蛋白乙酰转移酶1抑制矽肺纤维化

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)能否通过对α-微管蛋白乙酰转移酶1(α-TAT1)调节而发挥抗矽肺纤维化作用。方法Wistar大鼠随机分为3组:对照组、矽肺模型组、Ac-SDKP处理组,每组6只。原代培养大鼠的肺成纤维细胞分为5组:对照组、转化生长因子(TGF-β1)诱导组、Ac-SDKP预处理组(TGF-β1+Ac-SDKP)、α-TAT1沉默组(α-TAT1-siRNA+TGF-β1+Ac-SDKP)、α-TAT1过表达组(α-TAT1-cpDNA+TGF-β1+Ac-SDKP)。免疫组化检测大鼠肺组织中α-TAT1的表达与分布,Western blot检测大鼠肺组织及大鼠肺成纤维细胞中I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、乙酰化微管蛋白-α(Ac-Tubα)、α-TAT1蛋白的表达水平。结果矽肺模型组大鼠的肺组织中出现矽结节,α-TAT1在矽结节中表达缺失,Western blot结果显示,矽肺模型组和TGF-β1诱导的肺成纤维细胞中Col I和α-SMA蛋白表达上调,Ac-Tubα和α-TAT1蛋白表达下调。Ac-SDKP治疗可抑制该变化。Ac-SDKP对Col I、α-SMA表达抑制效应可被α-TAT1-siRNA阻断,而α-TAT1过表达可加强Ac-SDKP对Col I、α-SMA表达的抑制作用。结论Ac-SDKP通过调节α-TAT1的表达抑制肌成纤维细胞分化,发挥抑制矽肺大鼠肺纤维化的作用。

N-α-乙酰基转移酶10蛋白在宫颈癌中的表达及与患者临床特征的关系

目的探讨N-α-乙酰基转移酶10蛋白(NAA10p)在宫颈癌中的表达及与患者临床特征的关系。方法选取38例宫颈癌患者的宫颈癌组织及癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测NAA10p的表达情况,并对NAA10p表达与宫颈癌患者临床特征的关系进行分析。结果NAA10p在宫颈癌组织中的阳性表达率为73.68%,明显高于癌旁正常组织的23.68%,差异有统计学意义(P﹤0.01);分化程度为中高分化、国际妇产科联盟(FIGO)分期为Ⅰb~Ⅱa期和有淋巴结转移的宫颈癌患者宫颈癌组织中NAA10p阳性表达率均高于分化程度为低分化、FIGO分期为Ⅰa期和无淋巴结转移的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。结论NAA10p在宫颈癌组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织,分化程度为中高分化、FIGO分期Ⅰb~Ⅱa期和有淋巴结转移的宫颈癌患者的宫颈癌组织中阳性表达率较高,可作为判断宫颈癌发生发展及淋巴结转移的参考指标。

1-芳氨基乙酰基-4-芳乙酰基氨基硫脲的合成

利用超声波辐射与相转移催化联用技术合成了 10个新的 1 芳氨基乙酰基 4 芳乙酰基氨基硫脲化合物 ,这种合成方法具有反应条件温和、反应时间较短、产率较高等优点 .新化合物的结构利用IR ,1 HNMR ,1 3 CNMR和元素分析进行了表征 .

多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶-2在不同肿瘤组织中mRNA的表达差异

目的 :观察三种不同肿瘤组织中ppGalNAc T2的表达差异 ;方法 :本文采用RT PCR方法从mRNA水平上研究其表达 ,同时在同一反应管中进行内对照 β 微球蛋白的扩增以进行半定量分析 ;结果 :ppGalNAc T2在不同肿瘤组织中 ,其在肿瘤部分、癌旁部分与正常部分的表达水平不具有一致性 ;结论 :ppGalNAc T2具有组织特异性 ;不同肿瘤组织的糖基转移酶作为肿瘤标志基因有待进一步的研究。

探讨丙氨酸氨基转移酶IFCC法检测试剂中加入5＇-磷酸吡哆醛对结果的影响

目的探讨丙氨酸氨基转移酶（ALT）IFCC法检测试剂中加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。方法依据IFCC公布的酶学测定参考方法（37C）的SOPL]，使用该室建立的测定系统进行丙氨酸氨基转移酶测定，比较加入5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛两种试剂检测结果的相关性，并探讨加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。结果在参考实验室用加5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛的ALT试剂分别用参考方法检测22份临床标本，对检测结果进行比较，回归方程为y=0．854X＋1．3059，R2=0．9758，两种试剂的检测结果相关性良好，但两种方法的捡测结果差异有统计学显著性意义（P〈0．05）。用两种试剂分别检测14份混合血清，加入5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（x）=104．1536U／L；标准差（s）-1．5820；变异系数（CV）=1．5％，而未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（i）=88．7231U／L；标准差0）-0．5542；变异系数（CV）-0．6％。结论加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂与未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂有较好的相关性，但两组结果的差异有统计学意义。加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果约高20％，加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数高。

D-氨基酸氧化酶和戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰基转移酶基因在大肠杆菌中的克隆和共表达 Luo H等[Enzyme Microb Technol，2004，35（6-7）：514．518]

为了将头孢菌素C转化成-7-氨基头孢烷酸(7-ACA)，克隆了来源于变异三角酵母的D-氨基酸氧化酶(DAAO)基因和来源于假单孢菌的戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)酰基转移酶基因，并在重组大肠杆菌中表达。对DAAO重组菌BL21(DE3)/pET-DAAO而言，通过分批补料培养可获得250U／ml的高DAAO活性。信号肽序列缺失的GL-7-ACA酰基转移酶基因也成功地在重组大肠杆菌BL21(DE3)／pET-ACY中得到表达，