绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定

采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白,以水解物α-淀粉酶活性抑制率为主要指标,结合水解度、氨基酸组成及分子质量分析其抑制效果差异及原因。结果表明,绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高,为16.51%;与绿豆分级蛋白相比,绿豆蛋白的疏水氨基酸含量和水解度最高,分别为32.68%和6.28%,水解物的肽分子质量最小,均小于20kDa,因此选用绿豆蛋白制备α-淀粉酶抑制肽。然后分离鉴定绿豆蛋白肽,新发现了17条有潜在α-淀粉酶抑制效果的肽。本研究表明绿豆蛋白较其分级蛋白具有更强的α-淀粉酶抑制效果,能够用于降血糖的功能性食品或药物中。

青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以青香蕉为原料提取多酚,利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术对多酚提取物进行成分鉴定,并通过体外实验评价香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,探究青香蕉降血糖的部分机制。结果表明:青香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出28种化合物,包括21种多酚类化合物、2种有机酸、3种鞣花单宁代谢产物、以及香兰素和香豆素,检测到香蕉果肉中含有秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3种多酚类化合物,此外,二甲基鞣花酸和尿石素A为主要色谱峰;体外实验结果显示,香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均存在抑制作用,质量浓度为1.0 mg/mL时,对α-淀粉酶抑制率为(76.25±3.79)%,半抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.53 mg/mL;质量浓度为160μg/mL时,对α-葡萄糖苷酶抑制率为(92.54±0.69)%,IC50为35.76μg/mL。因此,多酚可能是青香蕉能够降血糖的活性成分之一。

生淀粉水解α-淀粉酶Amy486的重组表达和性质分析

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84菌株的amy486进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性。Amy486最适催化pH为7.5,在pH 6.5~8.5范围内酶活力保持40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h。1.5 mol/L Na_(2)SO_(4)处理可将Amy486的比酶活由1.53 U/mg提升至2209 U/mg。添加1.0 mol/L Na_(2)SO_(4),Amy486在35℃放置500 h,酶活力可保持60%以上。2.5 mmol/L CaCl_(2)可提升酶活力至110%,添加超过5 mmol/L CaCl_(2),Amy486的相对酶活力降至100%以下,EDTA孵育对Amy486蛋白的酶活力和稳定性影响较小。Amy486与钙离子结合的关键位点为K_(3)0_(2),K_(3)0_(2)E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性。α-淀粉酶Amy486及其突变体酶K_(3)0_(2)E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解。

红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定

为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重组蛋白的淀粉降解活性进行分析。结果表明:HpAMY3基因的开放阅读框长度为2742 bp,编码913个氨基酸;HpAMY3蛋白的理论相对分子质量为102370,理论等电点为pI 6.02,预测此蛋白位于叶绿体,且为亲水性蛋白。系统进化分析表明HpAMY3与拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtAMY3的亲缘关系最近,均属于AMYⅢ类。亚细胞定位实验结果显示HpAMY3定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)叶片的叶绿体,表明HpAMY3具有质体定位的特点。在授粉后20和23 d,红肉火龙果果实的α-淀粉酶活性较低;在授粉后25 d,α-淀粉酶活性显著(P<0.05)升高;在授粉后27和30 d,α-淀粉酶活性保持在较高水平。红肉火龙果果实的HpAMY3基因相对表达量在授粉后20和23 d较低,在授粉后25和27 d持续升高,在授粉后30 d略有降低。红肉火龙果果实发育期间α-淀粉酶活性与HpAMY3基因相对表达量的相关性较高(R^(2)=0.94)。体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有HpAMY3重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖,且二者含量极显著(P<0.01)高于含有载体对照pDR196的反应体系。综合上述结果,HpAMY3蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体;在果实发育期间,HpAMY3基因上调表达,HpAMY3具有淀粉降解活性。

不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂的活性和含量差异分析

探究不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂(α-AI)的活性和含量差异,为α-AI专用型白芸豆的品种选育和加工生产提供指导。以大白芸豆(YWL1、YWL2)、中白芸豆(Tbh1、Tbh2)、小白芸豆(云白1、云白2)品种为材料,对其营养成分、α-AI的活性和含量进行测定分析,并采用超滤膜进行不同分子量α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku)的分离,测定不同分子量α-AI的活性差异。结果表明,不同品种白芸豆的蛋白质、脂肪、淀粉和灰分含量差异明显,含量分别为17.5%~26.9%、1.1%~2.3%、32.9%~43.5%、3.8%~4.6%。云白1蛋白质含量最高(26.9%);YWL2灰分含量最高(4.6%),Tbh2脂肪含量最高(2.3%);α-AI的活性依次排序为YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2;α-AI的含量依次为云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2;将α-AI提取液进行膜分离得到3种不同分子量结构的α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku),活性平均值分别为(2315±313)、(11491±1226)、(45683±1914)U/g,依次是α-AI3>α-AI2>α-AI1。综合比较发现,YWL1具有较高的α-AI活性和含量,分别为23156 U/g和7.04%,更适于α-AI的生产。

发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

荞麦蜂花粉多酚对α-淀粉酶的抑制作用

蜂花粉多酚是一类能够有效降低血糖的天然物质。α-淀粉酶是高等生物体内血糖控制的关键酶,抑制其活性有助于控制餐后血糖。为探究蜂花粉多酚抑制α-淀粉酶发挥降糖活性的机制,本文以荞麦蜂花粉多酚(buckwheat bee pollen polyphenol,BBPP)为对象,采用比色法、荧光分光光度法研究BBPP对α-淀粉酶活性影响及其抑制机理。结果表明,BBPP能对α-淀粉酶产生较强的抑制作用,半抑制浓度(IC_(50))为2.00±0.06 mg/mL,抑制类型为可逆性混合型抑制。高温、强碱、光照以及高浓度氧化剂与还原剂等处理,均能降低BBPP对α-淀粉酶的抑制作用。在273~298 K和298~310 K时其结合过程分别为动态猝灭和静态猝灭。随着BBPP浓度增加,α-淀粉酶荧光最大发射波长产生蓝移,表明α-淀粉酶构象改变,疏水性增加。本研究发现荞麦蜂花粉多酚对α-淀粉酶具有较强抑制作用,对荞麦蜂花粉多酚的临床开发利用具有重要的理论参考价值。

白肾豆中α-淀粉酶抑制剂的超声波辅助提取工艺研究

目的:研究白肾豆中α-淀粉酶抑制剂提取的最优工艺。方法:采用超声波辅助提取白肾豆中α-淀粉酶抑制剂,研究了白肾豆粉细度、提取时间、提取温度、超声功率和料液比对白肾豆中α-淀粉酶抑制剂得率的影响。结果:通过单因素和正交实验,确定了最佳工艺条件为料液比1∶10(g∶mL)、提取温度60℃、提取时间100 min、超声功率200 W。依照优化条件进行重复试验,此时白肾豆中α-淀粉酶抑制剂的得率为4.51%。

Lineweaver-Burk双倒数法研究姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的动力学抑制活性

用Lineweaver-Burk双倒数法研究姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的动力学抑制类型。结果表明,姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制效果,抑制类型分别为竞争型抑制和混合型抑制,其抑制常数K_(ic1)、K_(ic2)分别为3.88和2.67。与α-淀粉酶相比,姜酚与α-葡萄糖苷酶结合的亲和力更好。

白芸豆提取物中α-淀粉酶抑制剂活性检测方法对比分析

本研究基于现有α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor,α-AI)活性检测方法的试验原理,通过验证3,5-二硝基水杨酸法和碘-淀粉显色法2种方法的精度,分析了不同检测方法在检测原理和检测结果准确性2个方面的差异。结果表明,3,5-二硝基水杨酸法是通过测量α-AI对3,5-二硝基水杨酸显色产物的吸光度变化来确定其活性,而碘-淀粉显色法则是利用碘离子与淀粉形成淀粉-碘络合物,通过观察溶液颜色的变化来测定α-AI的活性。从原理上来看,2种方法在测定α-AI活性时采取了不同的测定方式。从检测结果准确性方面来看,2种方法的准确性可能存在差异。3,5-二硝基水杨酸法能够准确测量α-AI对3,5-二硝基水杨酸的抑制能力,从而反映出其活性水平。而碘-淀粉显色法则是通过观察淀粉-碘络合物的颜色变化来判断α-AI的活性,这种方法可能受到其他因素的干扰,从而影响测定结果的准确性。本研究为准确并快速测定白芸豆α-AI产品提供方法,并为精确控制产品质量和生产流程提供参考。

白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的测定

根据碘试液与淀粉溶液呈蓝色这一特性,采用可见分光光度法,通过添加α-淀粉酶抑制剂(α-AI)前、后淀粉酶对淀粉水解促进作用的变化确定其抑制活性。结果表明,碘与淀粉络合后,在580 nm处产生特征吸收,ρ(α-AI)=0.003~0.018 mg/L,对α-淀粉酶活性抑制率与其质量浓度线性关系良好(r2=0.9905)。该实验方法条件易于控制、操作简单,为α-AI活性的研究提供参考。

嵌合信号肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的分泌

为提高α-淀粉酶的分泌效率,将不同天然信号肽的N,H和C区进行组合,以期筛选出优于天然信号肽的嵌合信号肽。首先从天然信号肽库中筛选了适合解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分泌的天然信号肽,以其中4种天然信号肽(SPyvcE,SPyoqM,SPBglS和SPyobB)的H区替换信号肽SPsacB的H区,构建4种嵌合信号肽RSP1—RSP4指导α-淀粉酶的基因工程菌株。结果表明,适合α-淀粉酶的最适天然信号肽和嵌合信号肽分别为SPyoqM和RSP1,且RSP1指导α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌的分泌效率较SPyoqM提高27%,较具有相同H区的SPyvcE提高了3.6倍,较仅H区不同的SPsacB提高了2.07倍。嵌合信号肽构建策略是一种有效提高α-淀粉酶分泌效率的方法,可为其他蛋白质的高效分泌提供参考。

低温冷害对不同玉米种子萌发及α-淀粉酶活性的影响

东北地区玉米春季播种时,常有“倒春寒”现象,低温冷害频发会造成玉米减产,针对这一问题,选择黑龙江省不同积温带种植的玉米杂交种为材料,以25℃为对照,以15和8℃为低温胁迫处理,研究低温冷害对不同玉米品种种子萌发特性和α-淀粉酶活性的影响。结果表明,低温冷害显著影响各品种种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和α-淀粉酶活性,表现为25℃>15℃>8℃。不同玉米品种抗低温能力差异显著,其中福玉208、中邦9号、呼单1779三个品种受温度影响较大,齐禾401、京农科728、嫩单19、富尔116、嫩单35这些品种抗低温能力较好。

鸡血藤提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

从鸡血藤中获得醇提物(alcohol extract,ESs)及水提物(water extracts,WSs),研究其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果表明,ESs的抑制效果显著高于WSs。为深入研究鸡血藤对2种酶的抑制作用,采用不同极性溶剂对ESs进一步萃取,获得W-ESs、D-ESs、N-ESs、E-ESs四个组分。实验结果表明,在同一浓度范围,ESs及4个组分的抑制效果存在差异。对α-淀粉酶的抑制效果为:W-ESs>D-ESs>ESs>N-ESs>E-ESs;对α-葡萄糖苷酶的抑制效果为:W-ESs>ESs>N-ESs>E-ESs>D-ESs。其中W-ESs对2种酶的抑制作用最好,IC_(50)值分别为(0.88±0.02)mg/mL和(15.82±2.79)μg/mL。绘制Lineweaver-Burk曲线确定酶抑制类型,结果显示,WSs、ESs、W-ESs及N-ESs对α-淀粉酶为反竞争性抑制,D-ESs和E-ESs为竞争性和非竞争性混合抑制。对于α-葡萄糖苷酶,W-ESs、D-ESs和E-ESs为反竞争性抑制类型,而WSs、ESs和N-ESs为反竞争性和非竞争性混合的抑制类型。研究结果表明,鸡血藤具有开发为降血糖药物的潜力。

3种黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制

黄酮类化合物可以通过抑制α-淀粉酶的活性来调节血糖水平,然而,黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制和二者构效关系的研究十分有限,特别是B环上的羟基化和C环上的糖基化对黄酮类化合物抑制α-淀粉酶的影响尚不清楚。为探究黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制机制和构效关系,分析了芦丁、槲皮素、山奈酚3种黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制类型、荧光淬灭特性、构象变化、结合力和结合位点。结果表明,山奈酚对α-淀粉酶的抑制能力最强,芦丁最弱。C环C3处的糖基化和B环C3’处的羟基化均削弱了黄酮类化合物对α-淀粉酶的抑制作用。淬灭亲和力被C环C3处的糖基增强,被B环C3’处的羟基削弱。3种黄酮类化合物主要通过氢键和疏水作用与α-淀粉酶自发结合,导致酶的结构和疏水微环境被改变,进而有效抑制α-淀粉酶的活性。研究旨在为富含黄酮类化合物的降血糖食品的开发和应用提供理论参考。

结合分子对接技术研究牦牛乳干酪苦味肽RK7和KQ7的α-淀粉酶抑制活性

以牦牛乳干酪苦味肽RPKHPIK(RK7)和KVLPVPQ(KQ7)为研究对象,通过生物信息学方法,使用ExPASy-ProtParam、Innovagen和PepDraw等工具计算RK7和KQ7的理化性质,利用分子对接技术揭示抑制α-淀粉酶的作用机制,结合体外实验测定α-淀粉酶抑制活性。研究表明:RK7和KQ7的分子质量分别为875.07 Da和779.98 Da,疏水性分别为42.86%和71.42%;分子对接显示α-淀粉酶中的His305、Glu233、Trp59和Trp58与RK7和KQ7的结合起重要作用,并且Asp197、Glu233和Asp300是影响α-淀粉酶活性的关键氨基酸;体外活性验证发现,RK7和KQ7α-淀粉酶的IC50分别为0.45 mg/mL和0.86 mg/mL。本研究通过生物信息学方法结合体外活性实验,高效快速获得牦牛乳源α-淀粉酶抑制肽,并通过分子对接技术探究分子间的作用机制,为α-淀粉酶抑制肽的研究提供新思路。

没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用及机理

从抑制率、抑制动力学、紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱及分子模拟方面研究没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用和机理。结果表明,没食子酸对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有良好的抑制效果,半数抑制浓度分别为(0.72±0.01)mmol/L和(0.59±0.02)mmol/L,以非竞争方式抑制α-淀粉酶,以混合竞争方式抑制α-葡萄糖苷酶。紫外光谱和荧光猝灭实验的结果表明,没食子酸通过改变α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶芳香族氨基酸残基周围的微环境,从而静态猝灭酶的荧光特性。圆二色谱分析表明,没食子酸能减少α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的α-螺旋结构含量,增加β-折叠、β-转角和无规卷曲结构含量,从而改变酶构象。分子对接结果显示没食子酸与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的结合主要是通过氢键和疏水相互作用。

体外模拟胃部消化对白芸豆α-淀粉酶抑制剂活性及结构的影响

为探究体外模拟胃部消化对α-淀粉酶抑制剂(α-AI)活性和结构特征的影响,实验以白芸豆为原料制备α-AI,探究体外模拟胃部消化不同时间产物的活性、粒径分布、Zeta电位、二级结构,以及巯基和二硫键含量。白芸豆中α-AI的分子质量约为34 ku,当消化时间大于90 min时产物对α-淀粉酶的抑制活性显著增加(P<0.05),粒径和Zeta电位绝对值显著降低(P<0.05);β-转角相对含量增加,无规则卷曲相对含量降低,总巯基、游离巯基含量均显著降低,二硫键含量显著升高。研究结果表明,体外模拟胃部消化过程中,白芸豆α-AI蛋白分子间的交互和聚集现象不断加剧,部分巯基发生氧化现象形成二硫键,形成稳定的蛋白质构象,能够在体内较好地发挥其抑制α-淀粉酶的活性。

海黄牡丹不同部位的成分分析、体外抗氧化能力及其α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制能力

为比较海黄牡丹的花瓣、花萼、雌蕊、雄蕊4个部位的化学成分和功能活性,测定其总酚、总黄酮含量,采用HPLC进一步分析5种多酚含量,并评估其抗氧化能力、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性抑制能力。结果表明,海黄牡丹4个部位的总酚含量介于347.72~917.82 mg GAE/g,总黄酮含量介于13.21~58.71 mg RT/g,其中雌蕊、花萼的总酚和总黄酮含量显著高于其他2个部位(P<0.05)。HPLC分析发现不同部位之间化合物成分含量差异显著;在定量的5个多酚化合物中,花瓣部位检测到的多酚种类最多,雄蕊部位芹菜素和异鼠李素含量最高(P<0.05)。此外,花萼部位有较强的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力,其IC_(50)值分别为44.97和74.44μg/mL,雌蕊部位的铁还原能力最强为691.46 mg FeSO_(4)/g。花瓣对α-葡萄糖苷酶有较好的抑制作用,而雄蕊则对α-淀粉酶的抑制能力最强,优于阳性对照阿卡波糖。综上结果,海黄牡丹的雌蕊和花萼部位具有较好的抗氧化能力,而花瓣和雄蕊部位具有一定的体外降血糖的能力。该研究为海黄牡丹开发为天然抗氧化、降血糖食品提供一定的科学依据。

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制动力学

通过超滤-高效液相色谱、酶动力学以及分子对接等方法研究矢车菊素-3-O-葡萄糖苷对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制的机制。结果表明,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷以可逆非竞争性的方式抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性。此外,荧光猝灭分析结果表明,在疏水作用力驱动下,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷可与两种酶结合生成复合物。分子对接结果显示,矢车菊素-3-O-葡萄糖苷通过氢键与疏水作用力与α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的关键氨基酸残基相互作用,其结合能分别为-7.8 kcal/mol和-9.8 kcal/mol。本研究为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷作为功能性膳食食品中α-淀粉酶/α-葡萄糖苷酶的潜在抑制剂的开发提供了新思路。