绿豆蛋白α-淀粉酶抑制肽的制备与鉴定

采用胃-胰蛋白酶水解绿豆蛋白及其分级蛋白,以水解物α-淀粉酶活性抑制率为主要指标,结合水解度、氨基酸组成及分子质量分析其抑制效果差异及原因。结果表明,绿豆蛋白肽对α-淀粉酶活性抑制率最高,为16.51%;与绿豆分级蛋白相比,绿豆蛋白的疏水氨基酸含量和水解度最高,分别为32.68%和6.28%,水解物的肽分子质量最小,均小于20kDa,因此选用绿豆蛋白制备α-淀粉酶抑制肽。然后分离鉴定绿豆蛋白肽,新发现了17条有潜在α-淀粉酶抑制效果的肽。本研究表明绿豆蛋白较其分级蛋白具有更强的α-淀粉酶抑制效果,能够用于降血糖的功能性食品或药物中。

青香蕉果肉多酚成分鉴定及其对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

以青香蕉为原料提取多酚,利用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱联用技术对多酚提取物进行成分鉴定,并通过体外实验评价香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,探究青香蕉降血糖的部分机制。结果表明:青香蕉果肉多酚提取物中共鉴定出28种化合物,包括21种多酚类化合物、2种有机酸、3种鞣花单宁代谢产物、以及香兰素和香豆素,检测到香蕉果肉中含有秦皮乙素、金丝桃苷、紫云英苷3种多酚类化合物,此外,二甲基鞣花酸和尿石素A为主要色谱峰;体外实验结果显示,香蕉果肉多酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均存在抑制作用,质量浓度为1.0 mg/mL时,对α-淀粉酶抑制率为(76.25±3.79)%,半抑制质量浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为0.53 mg/mL;质量浓度为160μg/mL时,对α-葡萄糖苷酶抑制率为(92.54±0.69)%,IC50为35.76μg/mL。因此,多酚可能是青香蕉能够降血糖的活性成分之一。

生淀粉水解α-淀粉酶Amy486的重组表达和性质分析

为明晰生淀粉水解α-淀粉酶Amy486独特的催化特征,将克隆自Exiguobacterium sp.J84菌株的amy486进行重组表达,并研究重组酶的酶学性质、嗜盐特性和钙离子依赖性。Amy486最适催化pH为7.5,在pH 6.5~8.5范围内酶活力保持40%以上,最适温度为35℃,30℃半衰期为100 h。1.5 mol/L Na_(2)SO_(4)处理可将Amy486的比酶活由1.53 U/mg提升至2209 U/mg。添加1.0 mol/L Na_(2)SO_(4),Amy486在35℃放置500 h,酶活力可保持60%以上。2.5 mmol/L CaCl_(2)可提升酶活力至110%,添加超过5 mmol/L CaCl_(2),Amy486的相对酶活力降至100%以下,EDTA孵育对Amy486蛋白的酶活力和稳定性影响较小。Amy486与钙离子结合的关键位点为K_(3)0_(2),K_(3)0_(2)E与钙离子的结合能力增强,从而降低该酶对外源钙离子的依赖性。α-淀粉酶Amy486及其突变体酶K_(3)0_(2)E是具有较高比酶活的生淀粉水解酶,对外源钙离子的依赖性较低,其活力的发挥依赖于适合的盐浓度,可应用于某些高盐环境下的淀粉水解。

带电短肽T_(7)+、T_(6)-对α-淀粉酶活性和构象的影响

利用带不同电荷的短肽T_(7)+、T_(6)-,探讨正电荷短肽T_(7)+和负电荷短肽T_(6)-对α-淀粉酶的活性和构象的影响。将短肽加入α-淀粉酶体系后,测定其相对酶活、米氏常数(Km)、活化能、Zeta电位等指标。为了更清晰地观察不同带电量的短肽对α-淀粉酶构象的影响,通过紫外吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色光谱进一步考察α-淀粉酶构象的变化。结果表明,将带电短肽加入α-淀粉酶的酶促反应中,正电荷短肽T7+抑制α-淀粉酶酶活,当短肽质量浓度为10^(-7)g/mL时,α-淀粉酶相对酶活降低2.40%,同时也使α-淀粉酶与可溶性淀粉的亲和力降低,活化能升高,Zeta电位增加。负电荷短肽T_(6)-促进α-淀粉酶酶活,当短肽质量浓度为10^(-7)g/mL时,α-淀粉酶相对酶活升高1.40%,同时也使α-淀粉酶与可溶性淀粉的亲和力升高,活化能降低,Zeta电位增加。光谱分析表明,不同带电短肽使α-淀粉酶的紫外-可见吸收光谱、荧光光谱以及二级结构发生不同程度的改变。这表明不同带电短肽可以发挥与电场相似的作用,即电场在作用于蛋白质时,产生的电场力促使蛋白质构象发生改变,人工设计合成短肽所带的表面电荷影响酶表面电荷的分布,进而导致酶的活性和构象发生改变。

不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂的活性和含量差异分析

探究不同品种白芸豆α-淀粉酶抑制剂(α-AI)的活性和含量差异,为α-AI专用型白芸豆的品种选育和加工生产提供指导。以大白芸豆(YWL1、YWL2)、中白芸豆(Tbh1、Tbh2)、小白芸豆(云白1、云白2)品种为材料,对其营养成分、α-AI的活性和含量进行测定分析,并采用超滤膜进行不同分子量α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku)的分离,测定不同分子量α-AI的活性差异。结果表明,不同品种白芸豆的蛋白质、脂肪、淀粉和灰分含量差异明显,含量分别为17.5%~26.9%、1.1%~2.3%、32.9%~43.5%、3.8%~4.6%。云白1蛋白质含量最高(26.9%);YWL2灰分含量最高(4.6%),Tbh2脂肪含量最高(2.3%);α-AI的活性依次排序为YWL1>YWL2>云白1>Tbh1>Tbh2>云白2;α-AI的含量依次为云白1>YWL1>Tbh1>YWL2>Tbh2>云白2;将α-AI提取液进行膜分离得到3种不同分子量结构的α-AI1(6~20 ku)、α-AI2(21~40 ku)、α-AI3(41~60 ku),活性平均值分别为(2315±313)、(11491±1226)、(45683±1914)U/g,依次是α-AI3>α-AI2>α-AI1。综合比较发现,YWL1具有较高的α-AI活性和含量,分别为23156 U/g和7.04%,更适于α-AI的生产。

麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶D246A异源表达及性质表征

以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,突变体耐热能力下降;最适pH值由WT的6.0升高至7.0,有利于工程菌生长;半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h,酶稳定性降低.酶动力学结果表明:突变体D246A酶动力学曲线符合Michaelis方程,与WT相比,K_(m)值变大,表明酶与底物亲和力下降;V_(max)约降低至原来的1/4.

红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定

为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重组蛋白的淀粉降解活性进行分析。结果表明:HpAMY3基因的开放阅读框长度为2742 bp,编码913个氨基酸;HpAMY3蛋白的理论相对分子质量为102370,理论等电点为pI 6.02,预测此蛋白位于叶绿体,且为亲水性蛋白。系统进化分析表明HpAMY3与拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtAMY3的亲缘关系最近,均属于AMYⅢ类。亚细胞定位实验结果显示HpAMY3定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)叶片的叶绿体,表明HpAMY3具有质体定位的特点。在授粉后20和23 d,红肉火龙果果实的α-淀粉酶活性较低;在授粉后25 d,α-淀粉酶活性显著(P<0.05)升高;在授粉后27和30 d,α-淀粉酶活性保持在较高水平。红肉火龙果果实的HpAMY3基因相对表达量在授粉后20和23 d较低,在授粉后25和27 d持续升高,在授粉后30 d略有降低。红肉火龙果果实发育期间α-淀粉酶活性与HpAMY3基因相对表达量的相关性较高(R^(2)=0.94)。体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有HpAMY3重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖,且二者含量极显著(P<0.01)高于含有载体对照pDR196的反应体系。综合上述结果,HpAMY3蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体;在果实发育期间,HpAMY3基因上调表达,HpAMY3具有淀粉降解活性。

人参α-淀粉酶抑制肽的降血糖作用

通过采用高糖高脂饲料联合腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建小鼠2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)模型,建模成功后连续4周给药治疗T2DM小鼠,以小鼠体质量、脏器指数、血糖、血脂、肝脏氧化应激反应、肝脏病理学检验结果作为参考指标,探究人参α-淀粉酶抑制肽对T2DM小鼠的降糖作用。结果表明,阿卡波糖阳性组和人参α-淀粉酶抑制肽各剂量组对小鼠的体重下降情况、高血糖情况均有不同程度的改善作用及调控效果,所以人参α-淀粉酶抑制肽各个剂量对T2DM小鼠具有降糖的效果。经过4周的治疗,高剂量组血糖从建模后的15.43 mmol/L下降至12.10 mmol/L与阿卡波糖阳性组血糖从建模后的15.71 mmol/L下降至10.17 mmol/L结果相近,且两组的小鼠肝脏损伤较轻,说明高剂量的人参α-淀粉酶抑制肽对2型糖尿病引发的肝脏损伤可起到明显的防护效果(P<0.01)。因此,人参α-淀粉酶抑制肽具有降血糖的作用和成为辅助治疗2型糖尿病产品或保健品的潜力。

马齿苋多糖的分离纯化及其对α-淀粉酶的抑制作用

以干、鲜马齿苋为原料,经提取、除蛋白、脱色、柱层析分离纯化制得干马齿苋多糖(POP-Dc1,POP-Dc2)和鲜马齿苋多糖(POP-Fc1,POP-Fc2).采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定两种马齿苋多糖对α-淀粉酶活性的抑制作用.结果表明,分离纯化的马齿苋多糖对α-淀粉酶活性均表现出一定的抑制作用,抑制能力大小为:POP-Fc1>POP-Dc1>POP-Fc2>POP-Dc2.其中,POP-Fc1抑制作用最强,在2.0 mg/mL下抑制率为(58.2±0.2)%.因此,鲜马齿苋分离纯化的多糖可更好地抑制α-淀粉酶活性,有望用于降糖药物及保健食品的开发应用.

发芽小麦高温α-淀粉酶挤压膨化工艺优化

为解决酿造食品工业中小麦原料还原糖和阿魏酸含量低的问题,利用高温α-淀粉酶挤压膨化处理技术对发芽小麦进行预处理,基于外源酶、内源酶与高温膨化共同作用促进原料中淀粉水解,以期提高其中的还原糖和阿魏酸含量。通过单因素和正交试验,确定最佳工艺条件为物料水分30%、加酶量0.18%、末端机筒温度90℃、螺杆转速80 r/min。在此条件下,还原糖和阿魏酸含量分别为38.39%和3.78 mg/g。与小麦原料和单一发芽处理相比,还原糖含量分别提高481.67%和20.95%,阿魏酸含量分别提高131.90%和38.97%。通过冷场发射扫描电镜(cold field emission scanning electron microscope,Cold FESEM)、傅里叶转换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)、高效体积排阻色谱(high performance size exclusion chromatography,HPSEC)表征,观察到发芽小麦的淀粉结构被破坏,其结晶度、短程有序度、重均分子量降低。高温α-淀粉酶挤压膨化处理发芽小麦能够促进还原糖的生成和阿魏酸的释放,为后续发酵食品的生产提供更好的发酵条件和更多的风味前体物质。

大豆多肽中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂的虚拟筛选及体外活性验证

目的:通过抑制碳水化合物消化酶的活性延缓碳水化合物的消化,来预防和控制糖尿病的作用已经成为多领域的研究热点。β-伴大豆球蛋白是大豆蛋白中含量最高的功能性蛋白,但其胃肠道消化后产生的多肽是否具有抑制碳水化合物消化酶的活性还不得而知。方法:将β-伴大豆球蛋白进行胃肠道模拟消化,通过虚拟筛选和ADMET预测选出α-葡萄糖苷酶抑制肽和α-淀粉酶抑制肽,检测多肽对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用。结果:通过胃酶、胰酶和糜蛋白酶将β-伴大豆球蛋白虚拟酶解成95个小分子多肽;筛选出8个α-葡萄糖苷酶抑制肽和α-淀粉酶抑制肽;发现氢键和静电相互作用在多肽与α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶结合中起重要作用;体外验证发现四肽EASY具有较强α-葡萄糖苷酶抑制效果,其IC_(50)值为208.6μg/mL,未发现明显α-淀粉酶抑制效果。结论:α-葡萄糖苷酶抑制肽EASY具有抑制碳水化合物消化酶的活性,可能成为控制糖尿病的潜在抑制剂。

荞麦蜂花粉多酚对α-淀粉酶的抑制作用

蜂花粉多酚是一类能够有效降低血糖的天然物质。α-淀粉酶是高等生物体内血糖控制的关键酶,抑制其活性有助于控制餐后血糖。为探究蜂花粉多酚抑制α-淀粉酶发挥降糖活性的机制,本文以荞麦蜂花粉多酚(buckwheat bee pollen polyphenol,BBPP)为对象,采用比色法、荧光分光光度法研究BBPP对α-淀粉酶活性影响及其抑制机理。结果表明,BBPP能对α-淀粉酶产生较强的抑制作用,半抑制浓度(IC_(50))为2.00±0.06 mg/mL,抑制类型为可逆性混合型抑制。高温、强碱、光照以及高浓度氧化剂与还原剂等处理,均能降低BBPP对α-淀粉酶的抑制作用。在273~298 K和298~310 K时其结合过程分别为动态猝灭和静态猝灭。随着BBPP浓度增加,α-淀粉酶荧光最大发射波长产生蓝移,表明α-淀粉酶构象改变,疏水性增加。本研究发现荞麦蜂花粉多酚对α-淀粉酶具有较强抑制作用,对荞麦蜂花粉多酚的临床开发利用具有重要的理论参考价值。

不同桑叶提取物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蔗糖酶的抑制作用研究

为了评价不同桑叶提取物对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蔗糖酶的抑制作用,采用不同工艺制备得到不同桑叶提取物并测定其成分含量,分别建立α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蔗糖酶的抑制测定方法,并测定不同桑叶提取物的抑制率和半抑制浓度(semi-inhibitory concentration,IC_(50))。结果显示不同桑叶提取物对α-淀粉酶有一定的促进作用,桑叶1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)提取物促进作用最小。对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用,桑叶DNJ提取物抑制作用最强。对蔗糖酶有不同程度的抑制作用,桑叶黄酮提取物、桑叶DNJ粗提取物抑制作用最强。表明不同桑叶提取物其活性成分标示含量不同,对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和蔗糖酶的抑制作用不同,对桑叶提取物辅助降血糖产品开发应用具有指导意义。

白肾豆中α-淀粉酶抑制剂的超声波辅助提取工艺研究

目的:研究白肾豆中α-淀粉酶抑制剂提取的最优工艺。方法:采用超声波辅助提取白肾豆中α-淀粉酶抑制剂,研究了白肾豆粉细度、提取时间、提取温度、超声功率和料液比对白肾豆中α-淀粉酶抑制剂得率的影响。结果:通过单因素和正交实验,确定了最佳工艺条件为料液比1∶10(g∶mL)、提取温度60℃、提取时间100 min、超声功率200 W。依照优化条件进行重复试验,此时白肾豆中α-淀粉酶抑制剂的得率为4.51%。

Lineweaver-Burk双倒数法研究姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的动力学抑制活性

用Lineweaver-Burk双倒数法研究姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的动力学抑制类型。结果表明,姜酚对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有明显的抑制效果,抑制类型分别为竞争型抑制和混合型抑制,其抑制常数K_(ic1)、K_(ic2)分别为3.88和2.67。与α-淀粉酶相比,姜酚与α-葡萄糖苷酶结合的亲和力更好。

血清淀粉酶、CA19-9、CA12-5及HE4联合检测在卵巢浆液性腺癌中的价值评价

目的探讨血清淀粉酶、CA19-9、人附睾蛋白(HE)4、CA12-5联合检测在卵巢浆液性腺癌中的价值。方法选取2020年11月—2021年10月本院收治的49例卵巢浆液性腺癌患者为病例组,52例卵巢良性疾病患者为良性病变组,63例同期接受健康体检的女性为健康组,均接受血清淀粉酶、CA19-9、CA12-5及HE4检查。分析上述肿瘤标志物单独或联合检测对卵巢浆液性腺癌的诊断价值。结果病例组CA12-5、HE4、血清淀粉酶、CA19-9水平高于良性病变组和健康组,组间对比差异有统计学意义(P<0.05);病例组CA12-5、HE4、CA19-9、血清淀粉酶阳性率高于良性病变组和健康组,组间对比差异有统计学意义(P<0.05);HE4、CA12-5、血清淀粉酶、CA19-9联合检测诊断符合率、敏感度、特异度均高于单独检测,组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论血清淀粉酶、CA19-9、CA12-5及HE4均在卵巢浆液性腺癌中表达,且联合检测诊断价值较单独检测更高。

白芸豆提取物中α-淀粉酶抑制剂活性检测方法对比分析

本研究基于现有α-淀粉酶抑制剂(α-amylase inhibitor,α-AI)活性检测方法的试验原理,通过验证3,5-二硝基水杨酸法和碘-淀粉显色法2种方法的精度,分析了不同检测方法在检测原理和检测结果准确性2个方面的差异。结果表明,3,5-二硝基水杨酸法是通过测量α-AI对3,5-二硝基水杨酸显色产物的吸光度变化来确定其活性,而碘-淀粉显色法则是利用碘离子与淀粉形成淀粉-碘络合物,通过观察溶液颜色的变化来测定α-AI的活性。从原理上来看,2种方法在测定α-AI活性时采取了不同的测定方式。从检测结果准确性方面来看,2种方法的准确性可能存在差异。3,5-二硝基水杨酸法能够准确测量α-AI对3,5-二硝基水杨酸的抑制能力,从而反映出其活性水平。而碘-淀粉显色法则是通过观察淀粉-碘络合物的颜色变化来判断α-AI的活性,这种方法可能受到其他因素的干扰,从而影响测定结果的准确性。本研究为准确并快速测定白芸豆α-AI产品提供方法,并为精确控制产品质量和生产流程提供参考。

α-淀粉酶水解马铃薯中淀粉提取还原糖参数优化

采用单因素实验方法及响应面法对α-淀粉酶水解马铃薯中的淀粉的酶用量、pH值、温度及时间等条件进行了优化。通过响应面法得出最佳组合条件为pH=6.0,酶加量37 mg(0.37%),酶解时间5.1 h,酶解温度66℃。在此工艺条件下马铃薯水解程度最大达到,还原糖提取率为5.104%与还原糖提取率预测值5.20%误差低于2%。酶解动力学试验结果显示,在不同的底物浓度条件下,酶解速率的变化规律符合米氏方程的特征。采用双倒数作图法计算出K m=99.13 g/L,V max=11.66 g/(L·h),得米氏方程式为V=2.92[S]/(99.13+[S]),R 2=0.99752,方程极显著,可很好地模拟α-淀粉酶酶解动力学过程。研究可以为资源化废弃马铃薯提供借鉴。

气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达

【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。

白芸豆中α-淀粉酶抑制剂活性的测定

根据碘试液与淀粉溶液呈蓝色这一特性,采用可见分光光度法,通过添加α-淀粉酶抑制剂(α-AI)前、后淀粉酶对淀粉水解促进作用的变化确定其抑制活性。结果表明,碘与淀粉络合后,在580 nm处产生特征吸收,ρ(α-AI)=0.003~0.018 mg/L,对α-淀粉酶活性抑制率与其质量浓度线性关系良好(r2=0.9905)。该实验方法条件易于控制、操作简单,为α-AI活性的研究提供参考。