α-突触核蛋白通过氨基端引起MN9D细胞线粒体膜损伤

目的在MN9D细胞中,探讨α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)氨基端(α-syn/N),NAC区,及C端(α-syn/C)对细胞及线粒体的作用。方法将细胞分为未处理组(control),空载体组(Myc),α-syn过表达组(α-syn),α-syn/N过表达组(α-syn/N),α-syn/del N过表达组(α-syn/del N),α-syn/NAC过表达组(α-syn/NAC),α-syn/C过表达组(α-syn/C),α-syn/del C过表达组(α-syn/del C)并瞬时转染α-syn各结构域48 h。用MTT和LDH法检测过表达α-syn各个结构域对细胞活力及LDH释放情况的影响,通过共聚焦显微镜及流式细胞仪检测细胞内ROS水平,线粒体渗透性转运孔(m PTP)的开放情况及线粒体膜电势(ΔΨm)变化,用免疫荧光染色检测线粒体形态。结果过表达α-syn,α-syn/N,α-syn/del C能使细胞活力下降(P<0.01),LDH的释放量明显增加(P<0.01),细胞内活性氧(ROS)水平增加(P<0.001),线粒体渗透性转运孔(m PTP)异常开放增加(P<0.01),线粒体膜电势下降(P<0.01)。并且过表达α-syn/N后,55%的线粒体出现气球样改变。结论α-syn通过其氨基端引起线粒体膜损伤。

人α-突触核蛋白A30P突变对小鼠成体大脑吻端迁移流中神经发生的抑制作用及其机制

目的:检测表达人α-突触核蛋白(SNCA)A30P突变的小鼠大脑吻端迁移流(RMS)中的细胞增殖水平,探讨SNCA A30P突变对小鼠成体大脑神经发生的可能影响。方法:选取C57BL正常小鼠、内源性SNCA敲除小鼠(SNCA-/-)和SNCA敲除+人SNCA A30P敲入小鼠(A30PSNCA-/-)各4只作为正常对照组、SNCA-/-组和A30PSNCA-/-组,取各组小鼠脑组织冠状冰冻切片,观察各组小鼠脑组织RMS形态学;行磷酸化组蛋白(PH3)、双皮质素(Dcx)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光免疫组织化学染色,统计PH3阳性细胞的数量和3组小鼠中Dcx阳性细胞的荧光强度。结果:各组小鼠RMS的形态、大小和细胞密度等无明显差异。与正常对照组比较,SNCA-/-组和A30PSNCA-/-组小鼠RMS中PH3阳性增殖性神经元数量明显减少(P<0.05)。与正常对照组比较,SNCA-/-和A30PSNCA-/-组小鼠神经母细胞的Dcx阳性细胞荧光强度轻微增加。结论:人SNCA A30P突变可能减弱成体大脑RMS中的神经细胞增殖而促进其迁移,因此对成体大脑RMS中的神经发生有一定抑制作用。

α-突触核蛋白对线粒体膜造成孔道样损伤

α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)作为第一个发现的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)致病基因,在PD发生发展过程中具有重要作用。尽管有研究发现,α-syn对线粒体功能有损伤作用,但其对线粒体膜的损害机制尚不明确。本实验旨在探究α-syn对线粒体膜形态的影响,并找到更加微观的方式观察线粒体膜的变化。Thy-1-α-syn转基因动物与野生型动物相比,线粒体膜电势降低17%(P<0.01),膜通透性增加20.5%(P<0.01),转基因组线粒体细胞色素C释放增多64%(P<0.01),这有可能引起线粒体自噬和细胞凋亡。原子力显微镜结果显示,野生型小鼠脑组织线粒体表面光滑,α-syn转基因小鼠脑组织线粒体表面发现有锯齿状改变,而且在过表达α-syn的原代神经元线粒体膜表面有许多小凹陷,出现口径60~200 nm,深达20~60 nm的孔道。这可能是α-syn对线粒体膜造成的孔道样损伤。过表达α-syn全长组和N端组的原代神经元电镜结果显示,线粒体膜被破坏,并且出现空泡样线粒体和自噬小泡。本研究发现,过表达α-syn可能在线粒体表面形成孔道样改变,α-syn的N端是引起线粒体膜损伤主要结构域。

识别α-synuclein N端结构域的单克隆抗体鉴定及免疫应用

目的分析5种识别α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)N端结构域的单克隆抗体1C16、2B8、2P21、3O18和1J6的特异性,为帕金森病(Parkinson s disease,PD)的早期诊断和免疫治疗提供抗体支持。方法体外蛋白重组技术获得人源α-syn蛋白(human-α-syn,h-α-syn)、鼠源α-syn蛋白(mouse-α-syn,m-α-syn)、β-syn蛋白、N端人源α-syn蛋白(α-syn/N)和去N端人源α-syn蛋白(α-syn/ΔN)。斑点印迹法鉴定5种单克隆抗体的特异性识别结构域,使用蛋白质印迹技术检测其对变性后的纯蛋白和鼠脑组织的识别情况。结果抗体1C16可以识别非变性的h-α-syn纯蛋白和小鼠脑组织中的变性的h-α-syn蛋白,不识别m-α-syn和β-syn。抗体1J6仅识别非变性的h-α-syn及α-syn/N纯蛋白,不识别变性后的全长α-syn纯蛋白和小鼠脑组织中的变性h-α-syn蛋白。结论筛选出的2种单克隆抗体具有特异性,可为本实验下一步生物标志物的酶联免疫吸附法测定检测和针对α-syn的免疫治疗提供基础。

α-突触核蛋白N-端结构域参与线粒体功能的调控

目的:确定α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域,并检测该结构域对线粒体功能的影响。方法:构建重组融合蛋白质粒pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N,转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀明确α-Synuclein蛋白与线粒体相互作用的功能结构域。使用表达α-Synuclein蛋白的病毒上清感染小鼠多巴胺能神经细胞MN9D,通过免疫荧光、流式细胞术检测线粒体膜电位及Cytochrome c释放。结果:成功构建了pCMV-myc/α-Syn-WT、pCMV-myc/α-Syn-N和pCMV-myc/α-Syn-△N融合蛋白质粒,免疫共沉淀明确α-Synuclein N-端为其功能结构域,JC-1染色发现N-端使线粒体膜电位降低,流式细胞术证实N-端使Cytochrome c释放明显增加。结论:α-Synuclein N-端是其与线粒体相互作用的功能结构域,N-端降低线粒体功能。

桃红四物汤对鱼藤酮诱导帕金森细胞模型保护作用

目的研究桃红四物汤对鱼藤酮致帕金森细胞模型的保护作用及对细胞氨基酸代谢与抗氧化活性的影响。方法将细胞分为0.025%二甲基亚砜(DMSO)溶媒组,鱼藤酮0.15μmol·L-1模型组和桃红四物汤(TSD)给药组(10,50和100μg·m L-1)。鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞24 h体外模拟帕金森模型。TSD与鱼藤酮同时加入,研究其保护作用。MTT法检测细胞活力;DAPI荧光染色观察细胞核型;Western蛋白印迹法检测细胞中α-突触核蛋白(α-synuclein)的表达;高效液相色谱柱前衍生化法测定细胞氨基酸含量;酶生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果模型组较DMSO对照组,细胞存活率显著降低(P<0.01),细胞形态与核型发生改变,α-synuclein表达显著升高(P<0.01);胞内10种氨基酸(谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸)含量显著降低(P<0.01),兴奋性神经递质谷氨酸与抑制性神经递质谷氨酰胺平衡失调;SOD活性显著下降(P<0.01)。TSD组与模型组相比,剂量依赖地逆转上述变化。结论 TSD对鱼藤酮造成的帕金森病模型具有保护作用,与TSD调整细胞氨基酸代谢的紊乱及增强抗氧化酶SOD活力有关。