血清胃泌素17、胃蛋白酶原、γ-突触核蛋白检测在老年消化道早癌、癌前病变诊断中的应用

目的分析血清胃泌素17(G-17)、胃蛋白酶原I(PG I)、胃蛋白酶原II(PG II)、γ-突触核蛋白(SNCG)检测在老年消化道早癌、癌前病变诊断中的应用价值。方法选取我院198例老年早期胃癌及癌前病变患者,均经内窥镜检查与病理证实,分为早癌组与癌前病变组,并取同期50例老年胃镜良性病变者为胃镜良性病变组,检测其血清G-17、PG I、PG II及SNCG水平,进行相关性分析,并采用受试者工作特征(ROC)曲线分析G-17、PG I/PG II联合SNCG对早期胃癌及癌前病变诊断效能。结果早癌组血清G-17、SNCG水平显著高于其余两组,且癌前病变组高于胃镜良性病变组(P<0.05);早癌组血清PG I水平、PG I/PG II显著低于其余两组,且癌前病变组显著低于胃镜良性病变组(P<0.05);PG I与G-17、SNCG呈负相关(P<0.05),G-17与SNCG呈正相关(P<0.05);ROC曲线分析显示,四项联合诊断敏感度为93.4%、特异度为96.0%,曲线下面积(AUC)为0.987,大于G-17、PG I、PG I/PG II及SNCG单独诊断(0.960、0.824、0.810、0.961)。结论血清G-17、PG I、PG I/PG II联合SNCG检测对老年早期胃癌及癌前病变具有较高诊断效能。

纤维状α-突触核蛋白聚集体激活NLRP3炎症小体的机制研究

目的探索纤维状α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集体激活NLRP3炎症小体诱导神经炎症的机制。方法构建纤维状α-synuclein聚集体,采用纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞,检测白介素(IL)-1β、IL-18、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等相关炎症因子和NLRP3、caspase-1、ASC等蛋白的表达和mRNA水平评价NLRP3炎症小体激活;采用乳酸脱氢酶释放(LDH)实验检测细胞焦亡的发生。机制研究部分,检测Toll样受体(TLR)2和TLR4的激活,并分别加入TLR2和TLR4抑制剂C29和TAK-242检测对纤维状α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活的影响及核转录因子-κB(NF-κB)的入核情况。结果Western blot和硫黄素T染色实验结果显示,纤维状α-synuclein聚集体成功制备。纤维状α-synuclein聚集体刺激BV-2小胶质细胞24 h后可激活NLRP3炎症小体,表现为IL-1β释放增加,相关蛋白NLRP3、caspase-1表达升高,NLRP3、ASC和IL-1β的mRNA水平显著增加,且核内NF-κB蛋白表达显著增加。LDH实验显示,纤维状α-synuclein聚集体不引起BV-2小胶质细胞焦亡。机制研究表明,纤维状α-synuclein聚集体可显著激活TLR2,但对TLR4表达无显著影响。TLR2抑制剂C29可显著抑制纤维状α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活,但TLR4抑制剂TAK-242对α-synuclein聚集体诱导的NLRP3炎症小体激活无显著影响。结论纤维状α-synuclein聚集体可激活NLRP3炎症小体,其机制可能与激活TLR2有关。

基于α-突触核蛋白原纤维的帕金森氏疾病模型的研究进展

帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,主要病理学标志为中脑黑质致密部可见部分的一种球状包涵体,称为路易小体(Lewy bodies,LBs)。LBs的主要成分为部分中空的放射状淀粉样纤维,而该淀粉样纤维的主要成分为α-突触核蛋白(α-synuclein,AS)。AS与PD的发生有着密切的关系,是PD致病机制研究中的关键蛋白。AS的原纤维具有独特的传播特性,且能诱发产生与PD病理相类似的一系列特征,因此其可以作为建立PD模型的全新材料。本文就基于AS原纤维的PD模型的研究进展进行综述。

高效制备重组人α-突触核蛋白原纤维方法的建立

通过设计PCR引物,从pcDNA3.1-α-syn载体中扩增人α-突触核蛋白的编码DNA序列,将其克隆至PGEX-5X-1载体中,成功构建了人α-突触核蛋白高效原核表达载体pGEX-5X-1-syn。转化BL21菌株后进行IPTG诱导,通过对诱导剂浓度、诱导时间和温度、纯化方法和原纤维培养条件的优化,获取了重组人α-突触核蛋白原纤维,采用硫黄素T染色和透射电镜方法确认原纤维的制备情况。结果发现,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃条件下诱导3 h,人α-突触核蛋白得到大量表达。采用GST融合蛋白纯化磁珠进行蛋白纯化,可快速高效获取高纯度的人α-突触核蛋白,纯化产量可达到25 mg/L。浓度为9 mg/mL的人α-突触核蛋白,在37℃,1000 r/min震荡条件下培养至6 d,可大量成功制备人α-突触核蛋白原纤维,并在透射电镜下成功观察到了原纤维的形态。α-突触核蛋白原纤维是建立PD模型的重要材料,以上结果建立了一套可快速高效制备重组人α-突触核蛋白原纤维的方法,为PD的动物模型及细胞模型的建立提供了重要的研究材料。

α-突触核蛋白原纤维诱导的帕金森病小鼠模型的行为表型及病理特征

目的:研究A53T突变型α-突触核蛋白(A53T αS)原纤维诱导的帕金森病(PD)小鼠模型的行为表型及病理学特征。方法:小鼠脑内黑质致密区(SNpc)定位注射5 μg A53T αS建立PD小鼠模型,造模3个月后,通过旷场试验、悬挂试验和Y迷宫检测模型小鼠的运动和认知行为学表型。分别使用抗磷酸化α-突触核蛋白(p Syn)、抗酪氨酸羟化酶(TH)及小胶质细胞特异性蛋白抗体IBA-1作为评价模型小鼠脑内的路易小体包涵体、多巴胺能神经元变性死亡及神经炎症的分子标记,通过免疫组织化学染色法研究模型小鼠脑内典型的病理特征。结果:旷场试验中,模型组小鼠的总运动距离较对照组差异无统计学意义(P>0.05);悬挂试验显示模型组小鼠四爪抓杆持续时间较对照组小鼠显著缩短(P<0.05);Y迷宫检测表明模型组小鼠的自发转换正确率较对照组差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比,模型组小鼠中脑SNpc区的pSyn阳性包涵体数量显著增多(P<0.01),同时TH阳性神经元数量显著减少(P<0.05),IBA-1阳性胶质细胞数量异常增加(P<0.01)。结论:脑内注射A53T αS原纤维可稳定诱导出PD小鼠模型,该模型小鼠表现出一定程度的肌力和平衡力下降;且可同时模拟出PD的路易小体包涵体、多巴胺能神经元缺失及过度激活的神经炎症等病理特征。

基于α-突触核蛋白的帕金森病动物模型研究进展

帕金森病(PD)是第二常见的神经退行性疾病。已有研究表明α-突触核蛋白(α-syn)与PD的发病有着密切的关系。国内外研究者利用α-syn的异位表达、过表达或脑内注射等方法来建立PD动物模型。近年来,α-突触核蛋白预制原纤维(α-syn PFFs)已用于动物模型的构建。α-syn PFFs在研究PD的起源及神经元病变传播中起促进作用。这些模型与传统化学毒素模型相比能够更好地复制PD患者特征性病理改变。本文基于α-syn的PD动物模型的研究进展进行综述。

分子动力学模拟Cu2＋对α-突触核蛋白(1-17)肽段构象变化的影响

利用分子动力学模拟研究铜离子(Cu2+)对α-突触核蛋白1-17号氨基酸肽段(α-synuclein(1-17))构象变化的影响,采用GROMOS 43A1力场对Cu2+-α-synuclein(1-17)复合体和α-synuclein(1-17)肽段单体分别进行了6组独立的分子动力学模拟,每组模拟时间为500ns,总模拟时间为3μs.研究结果表明:Cu2+与α-synuclein(1-17)肽段结合使其更易向β折叠片结构折叠,促进了其二级结构的形成,增强了构象的稳定性;Cu2+增大了α-synuclein肽段疏水残基的溶剂可及表面积,增强了其疏水残基的暴露程度.自由能分析指出,Cu2+-α-synuclein(1-17)复合体的自由能比α-synuclein(1-17)肽段低,构象稳定,采样空间紧密,其自由能极小构象为β折叠片结构.构象聚类分析进一步表明,Cu2+使得α-synuclein(1-17)肽段构象趋于稳定.总之,Cu2+诱导固有无序蛋白α-synuclein(1-17)肽段由无序向有序转变,降低了构象的自由能,同时Cu2+增强了α-synuclein(1-17)肽段的疏水性,使得α-synuclein肽段因疏水作用更倾向于形成β折叠片结构,加速其疏水性聚集.

家蚕丝蛋白重复片段替换人体α-突触核蛋白核心片段的研究

家蚕Bombyx mori丝丝心蛋白(silkfibroin)结晶域与人类帕金森综合症的致病蛋白α_突触核蛋白(α_synuclein,α_Syn)的积聚原理类似,都是由一段非常疏水的氨基酸组成的保守序列和一些无序卷曲,并在一定条件下发生整体的结构转换而发生纤维化所致。研究发现在这2种蛋白中存在的疏水片段是它们形成β折叠的关键。为了研究α_Syn蛋白的积聚核心在被别的积聚核心所替换后是否还可以正常纤维化,我们用PCR技术将家蚕丝丝心蛋白的核心片段替换α_Syn1-74(α_Syn74)的核心,组成一个重组蛋白α_Syn74SFX,纯化后温育6天,用ThT荧光和原子力显微镜检测该重组蛋白的结构,结果表明α_Syn74SFX未能发生纤维化。这说明具备能形成β片层的片段和无序卷曲这2个因素,并不能绝对使蛋白发生整体的结构转换。这对人工蚕丝的研究具有参考价值。

蛋白质二硫键异构酶与α-突触核蛋白的相互作用及对其聚集的影响

α-突触核蛋白(α-synuclein,αsyn)的错误折叠和聚集是帕金森症的疾病特征.分子伴侣蛋白质二硫键异构酶(PDI)可在体外结合αsyn的N端并抑制其聚集,但PDI的识别机制至今仍不明确.我们通过液体核磁共振(NMR)实验,发现人源PDI b'xa'可结合αsyn的N端区域.此外,硫黄素T(ThT)荧光实验结果表明PDI b'xa'会显著抑制αsyn的聚集.我们进一步利用NMR滴定实验确定了PDI主要通过b'结构域的疏水空腔结合αsyn.最后,我们以此构建了PDI结合αsyn的对接模型,并提出了PDI抑制αsyn聚集的作用机理.这一工作为理解PDI抑制αsyn聚集提供了实验依据.

嗅三针对帕金森病痴呆小鼠海马CA1区载脂蛋白E和病理底物表达的影响

目的:观察嗅三针干预对帕金森病痴呆(Parkinson’s disease dementia,PDD)小鼠海马CA1区载脂蛋白E(apolipoprotein E,Apo E)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)以及相关核心病理底物表达的影响,探讨嗅三针改善PDD认知功能的部分作用机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为空白组(Control)、假手术组(Sham)、模型组(Model)和电针组(AE),每组10只;采用单侧内侧前脑束(medial forebrain tract,MFB)注射6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)建立PD模型并筛选PDD小鼠。建模筛选成功后,电针组选取嗅三针进行电针治疗,各组小鼠干预14天后采用Morris水迷宫实验和穿梭箱实验评估各组小鼠学习记忆能力;HE染色观察海马CA1区细胞病理改变;免疫印迹法检测海马CA1区α-syn、Aβ、Apo E蛋白的表达;免疫荧光双标观察海马CA1区Apo E与GFAP的共定位率。结果:与模型组比较,电针组小鼠水迷宫逃避潜伏期缩短(P<0.01),穿越平台次数增加(P<0.05),穿梭箱主动回避次数增加(P<0.05),电击刺激平均时间减少(P<0.01)。模型组小鼠海马CA1区神经细胞排列稀疏、变性坏死,细胞核体积变小、浓染、结构不清,呈核固缩表现;而电针组小鼠海马CA1区神经元病变有明显改善,大部分细胞排列规则,细胞核圆而大,染色浅,形态清晰。电针组小鼠海马CA1区α-syn、Aβ、Apo E蛋白以及Apo E与GFAP共定位率均较模型组减少(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.05)。结论:嗅三针可提高PDD小鼠认知能力并改善神经元形态结构与功能,机制可能与其抑制星形胶质细胞Apo E表达从而减少海马CA1区α-syn、Aβ沉积有关。

血浆胶质纤维酸性蛋白、α-突触核蛋白水平与帕金森病病情进展的相关性

目的探讨帕金森病(Parkinson disease,PD)患者血浆胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、总α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)、磷酸化-α-突触核蛋白(phosphorylated α-synuclein,p-α-syn)浓度与疾病进展的关系。方法连续收集就诊于淮安市第一人民医院神经内科门诊及住院的PD患者63例(PD组),同期选取年龄、性别相匹配的健康体检者25例为对照组(HC组),利用ELISA技术检测PD组和HC组血浆GFAP、α-syn、p-α-syn水平。使用SPSS 25.0软件进行统计分析。采用Mann-WhitneyU检验比较两组GFAP、α-syn、p-α-syn水平的差异,对PD组GFAP与α-syn、p-α-syn水平进行Spearman相关分析;对PD组不同Hoehn-Yahr分期的GFAP、α-syn、p-α-syn水平进行Mann-WhitneyU检验及Spearman相关分析。结果 PD组GFAP[0.80(0.62,0.97)ng/mL,0.54(0.27,0.88)ng/mL,Z=-3.216,P=0.001]、α-syn[3.93(3.16,6.02)ng/mL,2.67(1.74,4.47)ng/mL,Z=-2.600,P=0.009]、p-α-syn[5.80(1.31,15.62),0.71(0.61,0.83),Z=-6.607,P<0.001]水平高于HC组,差异有统计学意义。Spearman相关分析结果显示,PD组GFAP与α-syn(r=0.442,P<0.001)、p-α-syn(r=0.493,P<0.001)均呈正相关。PD中晚期组GFAP高于PD早期组,差异具有统计学意义(Z=-2.062,P=0.039);PD患者不同H-Y分期间α-syn与p-α-syn差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman相关性分析显示,GFAP与H-Y分期呈正相关(r=0.277,P=0.018)。结论 PD患者血浆GFAP水平与疾病进展呈正相关,可作为PD病情评估的一个潜在的生物标志物。

星形胶质细胞纤维生长和突触形成的方向性和特异性

背景:星形胶质细胞除了被动地起代谢和结构支持的作用外,还能够以更复杂的方式与神经元相互作用,主动地参与中枢神经系统的信息处理。目的:通过观察星形胶质细胞纤维生长和突触形成的方向性和特异性,探索星形胶质细胞在与神经元相互作用中的可能机制。方法:取新生24 h内绿色荧光蛋白转基因小鼠,以原代细胞分离培养和爬片方法获得海马原代细胞,以胶质原纤维酸性蛋白荧光免疫组化方法特异性标记星形胶质细胞,在共聚焦显微镜下观察结果。结果与结论:星形胶质细胞纤维向距离较远的锥体细胞定向伸长,并且终止于锥体细胞的胞体,末端与锥体细胞的胞体形成突触样结构;而且并不是所有的突起都伸向临近的细胞,其突触样结构的形成也不全是在最临近的位点。表明星形胶质细胞纤维伸长和突触形成具有方向性和特异性,为进一步探索星形胶质细胞与锥体细胞之间的信号传导提供依据。

儿茶酚异喹啉类物质Salsolinol(Sal)对α-Syn纤维化程度的影响

目的:研究儿茶酚异喹啉类物质1-甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(salsolinol,Sal)对帕金森病关键蛋白α突触核蛋白(α-syulcein,α-syn)纤维化程度的影响。方法:将重组人源α-Syn蛋白与不同浓度的Sal共同孵育,通过Th T染色对α-Syn成纤维状况进行监测。同时,利用扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察α-Syn与Sal共孵育后的形态变化。结果\结论:实验结果表明Sal具有将α-Syn稳定在寡聚体或者原纤维状态的能力,且呈浓度依赖性,Sal浓度越大,α-Syn纤维化进程越缓慢。这一发现为进一步研究α-Syn和儿茶酚异喹啉类物质在PD发生和发展过程中起到的作用提供了一定的实验依据。

中枢神经细胞瘤临床病理分析

目的：了解中枢神经细胞瘤镜下形态及神经元特异核蛋白（NeuN）、突触素（SYN）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、少突胶质细胞转录因子乏（Olig-2）、上皮膜抗原（EMA）和Ki-67的表达。方法：选择8例中枢神经细胞瘤外科手术标本及1例会诊标本，采用HE染色镜下观察其形态特点；采用免疫组织化学方法检测NeuN、SYN、GFAP、Olig-2、EMA和Ki-67的表达。结果：中枢神经细胞瘤细胞由单一圆形细胞围绕分支状的毛细血管呈蜂窝状排列；免疫组织化学示肿瘤细胞SYN及NeuN均为阳性，Ki-67增殖指数为1％～2％，GFAP灶性阳性，Oligo-2和EMA阴性。结论：中枢神经细胞瘤具有一定的病理形态特征，免疫组化标记有助于诊断。