白藜芦醇改善α-突触核蛋白A53T转基因小鼠运动功能障碍和调节外周免疫的作用研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,RES)对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)A53T转基因小鼠运动功能障碍及外周免疫的影响。方法选取8月龄的A53T转基因小鼠,随机分成4组:对照组(WT)、对照治疗组(WT+RES)、模型组(PD)、模型治疗组(PD+RES)。治疗组每3 d灌胃RES,用药3个月;对照组和模型组给予等量生理盐水。通过爬杆实验、转棒实验、前脚抓力实验、四肢抱紧实验检测各组小鼠运动水平。流式细胞仪检测小鼠T淋巴细胞亚群,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-18(IL-18)以及转化生长因子-β(TGF-β)的水平。结果与对照组相比,模型组运动功能评分均较低;与模型组相比,模型治疗组运动功能评价显著改善。流式结果显示,与对照组比,模型组小鼠外周T细胞占比、CD4^(+)T细胞占比、CD4^(+)/CD8^(+)比值均降低,CD8^(+)T细胞占比无统计学意义。与模型组相比,模型治疗组T淋巴细胞占比和CD4^(+)T细胞占比均显著升高,有统计学意义,CD4^(+)/CD8^(+)比值也升高,但差异无统计学意义。外周血血清ELISA结果显示,与对照组相比,模型组小鼠IL-6、IL-18均升高,TGF-β降低,TNF-α浓度无统计学差异。与模型组相比,模型治疗组IL-6、IL-18浓度显著下降,TGF-β有所上升,结果无统计学意义。结论RES通过调节小鼠外周免疫,减少神经炎症反应,从而显著改善A53T转基因小鼠的运动功能障碍。

A53T转基因小鼠体内α-突触核蛋白改变研究

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)A53T转基因小鼠体内α-syn的分布和修饰变化情况。方法采用α-syn A53T转基因小鼠作为帕金森病(parkinson's disease,PD)模型小鼠,应用Western blot实验方法来检测A53T转基因小鼠和野生型C57BL/6小鼠的胃、黑质和纹状体中α-syn的表达含量和异常聚集情况。结果相比于野生型小鼠,A53T转基因小鼠的胃、黑质和纹状体中α-syn(C-20)、硝基化α-syn(n-syn)表达均显著增加;胃和黑质中的磷酸化α-syn(p-syn)含量降低,纹状体中p-syn含量升高;黑质和纹状体中寡聚体形式的α-syn(5G4)含量升高,胃中含量降低。其中,n-syn在胃组织中含量最高,寡聚体形式的α-syn在黑质部位含量最高,p-syn在纹状体部位含量最高。结论A53T转基因小鼠体内α-syn总蛋白增加,而异常修饰和聚集化的α-syn在不同器官内的含量变化有所差异,提示A53T相关的α-syn病变有组织特异性分布特点。

携带A53T突变人α突触核蛋白转基因帕金森病大鼠模型的建立

目的大鼠在神经系统疾病模型方面比小鼠有更好的表现，建立人α-synA53T突变型转基因大鼠模型，为研究帕金森病发病提供更优良的疾病模型。方法构建人α—synA53T表达载体，显微注射法制备转基因大鼠。PCR法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。Western blot检测转基因大鼠脑组织中人α-syn蛋白的表达。免疫组化和免疫荧光观察中脑黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目变化，观察人α-syn蛋白在转基因大鼠黑质神经元中的表达和分布。Rotatingrod实验和步态分析系统评价转基因大鼠的行为学改变。结果获得1个α-synA53T高表达且可以稳定传代的转基因大鼠品系。转基因大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶（TH）阳性神经元数目减少69％（P〈0．05），残存神经元胞浆中有大量的α—syn蛋白聚集。转基因大鼠在滚轴上保持平衡的时间显著减少40％～60％（P〈0．05），并表现出步态障碍如步宽加大、摆动期缩短和足迹最大接触面积减小等。结论建立了人α-synA53T突变型转基因的帕金森病大鼠模型。

α-突触核蛋白促进原代神经元及转基因小鼠神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的在原代培养神经元及转基因动物水平上,研究α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)对神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting测定NMDA受体(NMDA receptor,NMDAR)和Rab5B质量分数。Rab5B反义寡核苷酸抑制Rab5B基因表达。以原代培养神经细胞及转基因小鼠为模型,观察α-Syn蛋白增多对细胞膜NMDAR质量分数的影响以及Rab5B的作用。结果在细胞及动物水平,α-Syn明显上调Rab5B表达,促进NMDAR的内在化。而抑制Rab5B表达可消除α-Syn致NMDAR的内在化。结论α-Syn通过上调Rab5B的表达促进NMDAR的内在化。

α-突触核蛋白转基因帕金森病模型小鼠早期出现社交认知障碍

目的:探讨α-突触核蛋白(αS)转基因(TG)帕金森病(PD)模型小鼠早期的非运动行为及相关病理改变。方法:以6月龄A53T突变型αS(A53TαS)TG小鼠作为早期PD小鼠模型,通过旷场实验、悬挂实验及精细运动实验评估PD模型小鼠的运动能力;通过Y迷宫自发交替行为实验、高架十字迷宫、悬尾实验和三箱社交实验分别评价PD模型小鼠的工作记忆、焦虑、抑郁样情绪及社交认知能力等非运动行为学表型;通过免疫组化检测PD模型小鼠脑内黑质区多巴胺(DA)能神经元及皮层区αS病理性包涵体;通过Western blot检测PD模型小鼠脑内黑质区酪氨酸羟化酶(TH)及皮层区Polo样激酶2(PLK2)的表达水平。结果:行为学实验结果显示,A53TαS TG PD模型小鼠的总移动距离、悬挂时间、磕瓜子数目、自发转换正确率、开放臂停留时间及肢体静止不动时间均未发生显著改变,但在三箱社交实验第3时相中与新目标鼠的交流时间显著减少(P<0.01)。免疫组化及Western blot结果显示,A53TαS TG PD模型小鼠脑内黑质区DA能神经元及TH表达水平未出现显著改变,但皮层区出现αS病理性包涵体及PLK2表达水平上调(P<0.01)。结论:A53TαS TG PD模型小鼠早期未出现运动、工作记忆及情绪样行为异常,但表现出社交认知障碍,可能与皮层中αS病理性包涵体相关。

miR-7促进A53T转基因小鼠SVZ区成年神经再生的机制研究

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一种严重危害人类健康的神经退行性疾病，其主要的病理学特征是黑质致密区（SNc）多巴胺能（DA）神经元的进行性丢失和α-突触核蛋白（α—synuclein）异常聚集和沉积形成的Lewy小体。

α-突触核蛋白的突变体A53T对小胶质细胞激活的影响

目的:探究重组人的野生型α-突触核蛋白(wild type alpha-Synuclein,WTα-Syn)和重组人的α-突触核蛋白突变体A53T(α-Synuclein mutant A53T,α-Syn A53T)对原代小胶质细胞的影响。方法:无菌培养原代小胶质细胞,细胞静息状态下加药处理,通过免疫荧光染色观察小胶质细胞的形态和Western Blot半定量分析CD11b的变化。结果:高浓度的WTα-Syn可以激活小胶质细胞;CD11b蛋白表达量明显升高;而2μmol/L和5μmol/L的α-Syn A53T均能激活小胶质细胞,CD11b蛋白表达量均升高。结论:相同浓度的WTα-Syn和α-Syn A53T,α-Syn A53T更容易激活小胶质细胞。

APP/PS1双转基因AD小鼠术后认知功能紊乱及其机制

目的探究阿尔茨默海病(AD)双转基因小鼠(APP/PS1)在麻醉手术后不同时程的认知功能改变及其可能的机制。方法将APP/PS1小鼠随机分为对照组(不予手术麻醉干预)和实验组(2.5%七氟烷麻醉下行剖腹探查术)。术后1和3 d行条件恐惧实验评估小鼠认知功能;并分别在术后12及24 h和3 d用酶联免疫吸附实验检测海马组织炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α及淀粉样蛋白Aβ_(42)蛋白含量;用Western blot检测α-突触核蛋白的表达。结果与对照组相比,实验组小鼠在术后1和3 d,与场景有关的僵直时间均显著减少。术后24 h实验组小鼠海马组织内IL-1β、IL-6及TNF-α的含量显著高于对照组(P<0.05);同时Aβ_(42)蛋白和α-突触核蛋白的表达在术后24 h也显著上调(P<0.05)。结论 AD双转基因小鼠接受麻醉手术后,在术后早期即可出现认知功能障碍,其发生机制可能与海马区α-突触核蛋白与Aβ_(42)表达异常及神经炎性反应相关。

新生乳鼠侧脑室注射rAAV2/9递送SNCA构建全脑转基因鼠

目的快速高效地构建一种人源SNCA(hSNCA)的全脑转基因鼠,并初步探究α-突触核蛋白过表达对小鼠中枢神经系统的影响。方法对新生乳鼠进行双侧侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射携带人源SNCA-EGFP或EGFP的重组腺相关病毒2/9(recombinant adeno-associated virus2/9,rAAV2/9)(1.5×10^(13) genome copies(GC)/mL),在2周和3个月龄用免疫荧光及Western blot检测α-突触核蛋白的表达模式及亚细胞定位,并用免疫荧光及免疫组化探究星形胶质细胞、小胶质细胞及病理性α-突触核蛋白的变化。结果用rAAV2/9侧脑室注射的方式成功构建了hSNCA全脑转基因鼠,α-突触核蛋白在整个脑中广泛表达,且趋向于在嗅球、皮层、海马、间脑及中脑中高表达。进一步研究发现,在嗅球、皮层、海马的CA2/3区及小脑的浦肯野细胞中观测到α-突触核蛋白在神经元胞核中表达的现象,α-突触核蛋白过表达引起了胶质增生。此外,在嗅球及大脑皮层检测到α-突触核蛋白Ser129磷酸化(pS129)及聚集。结论快速成功地构建了一种hSNCA全脑转基因小鼠模型,其α-突触核蛋白持久地高表达,并出现胶质增生和病理性α-突触核蛋白表达的现象,为研究α-突触核蛋白的生理功能及其在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中的作用奠定一定的基础。

一个农药接触群发性帕金森病家系α-突触核蛋白基因的研究

目的 探讨α-突触核蛋白（SNCA）基因A53T位点突变、A30P位点突变与一个群发性帕金森病家系的关系,进而探讨该家系帕金森病的发病病因是否与遗传因素相关。方法 该家系病史特点其父为当地农药商人,他们共同特点有长期农药接触史（其中包括百草枯和有机磷农药）。对该家系3例患者及3例正常成员进行系统的临床检查明确诊断原发性帕金森病后,提取该家族患者及健康人的静脉血,提取人类白细胞组DNA后,通过聚合酶链反应技术（PCR）对SNCA的4号外显子（Exon4）A53T位点及3号外显子（Exon3）上的A30P位点进行扩增,扩增后的产物经限制性内切酶反应多肽技术充分反应,限制性内切酶消化后的产物经紫外线凝胶电泳成像仪分析是否存在基因突变。结果 所有研究对象的SNCA基因Exon3经PCR扩增后的片段长度为192 bp,经特异性限制性内切酶MvaⅠ充分消化后,凝胶电泳成像结果为单一条带,即未发现A30P突变。SNCA基因Exon4经PCR扩增后的片段长度为216bp,经限制性内切酶Tsp45Ⅰ充分反应后,凝胶电泳成像结果为单一条带,即未发现A53T突变。结论 SNCA基因A30P、A53T点突变可能不是该家系患帕金森病的易感因素,而是与该家系长期接触农药相关,或与其他基因相互作用。

丁苯酞对路易体病小鼠认知改善作用的研究方案

目的:检测丁苯酞对路易体病小鼠认知功能的影响,在认知行为学改善的前提下探索其作用机制。方法:实验分为3组,即Con组、α-synuclein A53T突变的转基因小鼠组(A53T组)和NBP组(A53T突变的转基因小鼠+NBP),每组10只12月龄小鼠。NBP组腹腔注射NBP(0.2 ml/天,持续14天),Con组和A53T组腹腔注射生理盐水(0.2 ml/天,持续14天),NBP组腹腔注射NBP(0.2 ml/天,持续14天),通过旷场、条件恐惧、转棒、嗅觉检测等行为学测试。电镜观察小鼠线粒体、突触形态变化,显微镜计数小鼠黑质细胞数目,应用免疫组化检测小鼠纹状体及黑质的TH细胞以及α-synuclein含量变化。Western Blot:蛋白质印记检测线粒体自噬相关蛋白,融合分裂蛋白的变化。

天麻对帕金森小鼠神经元保护作用机制的转录组学分析

目的：研究天麻水煎液对A53Tα-突触核蛋白（α-synuclein）转基因帕金森小鼠的治疗作用,及其对凋亡相关通路表达的影响。方法：以A53Tα-synuclein转基因帕金森小鼠为实验对象,设置模型组、天麻组、空白组、阳性组（美多芭组）;采用基因型鉴定法、苏木素-伊红（HE）染色法和行为学实验测定小鼠中脑黑质神经元病理改变,以判断造模是否成功;Illumina Hi Seq 2500平台测序,检测天麻组所有基因转录本的差异表达,通过功能注释和富集分析筛选出与帕金森保护相关的基因及代谢途径。结果：预给予天麻水煎液治疗后能改善A53Tα-synuclein转基因帕金森小鼠中脑黑质神经元病变,转录数据分析显示其作用机制主要涉及原癌基因大鼠肉瘤（Ras）,p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）及Ca2＋等相关凋亡途径的抑制或激活调控。与模型组相比,天麻组中多巴胺第三受体,神经肽Y,Ras蛋白特异鸟嘌呤核苷酸释放因子1,钙/钙调蛋白依赖的磷酸二酯酶1A等基因表达上调,原癌基因c-Fos,p38 MAPK和人促分裂素原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶3等凋亡基因表达下调。结论：天麻水煎液对A53Tα-synuclein转基因帕金森小鼠具有一定的治疗作用,其机制可能与抑制多种凋亡相关信号通路有关。