一种非精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸肽对血小板聚集和ERK1/2磷酸化作用的研究

目的观察一种非精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)肽(P1c,专利公开号:101497656)对血小板聚集的影响和细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化的作用。方法固相合成法制备P1c;将不同浓度(0～2.6 mmol/L)的P1c加入富血小板血浆中,以二磷酸腺苷(ADP)为诱导剂,检测血小板聚集率;用western blot检测小肽干预后对总ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果 P1c以浓度依赖方式抑制血小板的聚集;其对总ERK1/2的表达无影响,而显著降低血小板p-ERK1/2的表达(P<0.05)。结论 P1c可能通过抑制ERK1/2的磷酸化而减少血小板的聚集。

含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰序列短肽的合成及应用研究进展

精氨酰 -甘氨酰 -天冬氨酸 (RGD)是具有生物活性的短肽序列之一。它是大多数细胞表面粘附分子能识别的配体上的最小氨基酸序列 ,在内皮细胞的识别、抗血栓、抑制肿瘤 ,治疗烧伤和皮肤溃疡等方面具有重要的作用。本文综述了近年来国内外对含RGD序列短肽的合成及其应用研究进展。

精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸多肽层层自组装修饰钛片对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的影响

目的研究层层自组装精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)多肽修饰钛片对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的影响。方法将纯钛试件随机分为3组:纯钛组(PT组)、NaOH处理钛片组(NT组)、RGD修饰钛片组(RT组)。根据分组对纯钛试件进行相应表面处理,扫描电子显微镜(SEM)观察试件表面形貌。将MC3T3-E1细胞在试件表面培养,采用SEM、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞的黏附和增殖能力,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测成骨细胞骨钙素、骨保护素mRNA的表达。结果 SEM观察到PT组试件表面存在均匀、较清晰的划痕结构,NT组试件表面出现微孔结构,RT组试件表面有类似小凸起结构,似网状。SEM观察到RT组细胞呈多边形且有大量丝状伪足,细胞伸展状态明显好于其余2组;MTT法显示RT组细胞的黏附率最高,无钛片对照组和PT组的细胞黏附率的差异无统计学意义,NT组细胞黏附率最低;RT组的细胞增殖率均高于其余3组(P<0.05),在1和3 d最为明显;RT-qPCR检测14 d时RT组骨钙素mRNA和骨保护素mRNA均高表达。结论 RGD多肽修饰钛片能促进小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的黏附和增殖,并且能够上调骨钙素mRNA和骨保护素mRNA的表达。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的脂质体雷公藤甲素靶向抗肿瘤效果

目的 制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽修饰的脂质体雷公藤甲素,探讨RGD肽靶向脂质体雷公藤甲素（RGD-TPL-LPs）纳米药物在小鼠移植性肝癌模型的靶向效果及药效.方法 通过成膜法制备具有靶向作用的脂质体纳米药物（RGD-TPL-LPs）,并观察细胞毒性.建立小鼠移植肝癌肿瘤模型并评价药效.结果 靶向修饰脂质体RGD-TPL-LPs的肿瘤细胞毒性明显强于无靶向脂质体（TPL-LPs）.此外,RGD靶向修饰的RGD-TPL-LPs抑瘤率为61.2％,要明显高于无靶向TPL-LPs的45.2％和游离雷公藤甲素的20.0％.结论 RGD靶向修饰的雷公藤甲素脂质体能够明显抑制肿瘤的生长,具有显著的抗肿瘤效果.

含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰环两亲性肽自组装凝胶与骨髓间充质干细胞相容性研究

目的分析骨髓间充质干细胞(BMSCs)与两亲性肽三维凝胶的相容性。方法取3周龄SD健康大鼠3只,分离股骨、胫骨获取BMSCs,采用流式细胞术检测BMSCs表面抗原;将10mg/mL含精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰(RGD)环两亲性肽溶液加入等体积DMEM/F12培养基数秒后自组装成三维凝胶,透射电镜显微镜(TEM)下观察三维凝胶结构;1×10~6 cells/mL BMSCs悬液与RGD环两性亲肽混合形成三维培养体系,1×10~6 cells/mL BMSCs悬液与多聚赖氨酸混合形成二维培养体系,无血清培养;CCK-8法观察细胞生长情况,钙黄绿素乙酰氧基甲酯/碘化丙啶(PI)双标染色,荧光显微镜观察RGD环两性亲肽对BMSCs增殖的影响。结果分离培养的细胞高表达CD29、CD90,不表达或低表达CD34、CD45;TEM显示凝胶由多空纳米纤维构成,纳米纤维直径2~5nm,长度100~1 000nm;质谱测得合成多肽相对分子质量为1 256.37,与理论值一致;高效液相色谱分析两性亲肽纯度为95.88%;钙黄绿素乙酰氧基甲酯/PI双标染色显示,三维培养体系中,30min后少数BMSCs出现死亡,12h后细胞开始增殖,增殖较二维培养活跃,差异有统计学意义(P<0.05);CCK-8细胞计数显示,三维培养体系细胞增殖活力高于二维培养体系,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RGD两性亲肽与BMSCs有良好的生物相容性,可能成为组织工程支架材料。

PAP-M6P与RGDY对肝星状细胞活化功能的联合干预作用

背景:活化的肝星状细胞(HSC)表面6-磷酸甘露糖/胰岛素样生长因子Ⅱ(M6P/IGFⅡ)受体和整合素受体显著增加。外源性含有M6P或精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)基团的分子可干预HSC活化,但目前尚缺乏两者比较或联合应用的研究。目的:探讨人工化学合成的p-氨基苯基-6-磷酸-α-D-甘露糖(PAP-M6P)和精氨酰-甘氨酰-天冬氨酰-酪氨酸(RGDY)小肽对HSC活化功能的联合干预作用。方法:取培养10d的活化期HSC,分别设空白对照组、RGDY对照组、PAP-M6P低、中、高浓度组以及低、中、高浓度联合组进行干预。以甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞抑制率,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转化生长因子(TGF)-β1mRNA表达,以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测Ⅰ型胶原、透明质酸和活化的TGF-β1蛋白含量。结果:各组细胞抑制率无明显差异。中浓度联合组TGF-β1mRNA表达和中、高浓度联合组活化的TGF-β1蛋白含量显著低于RGDY对照组和相应浓度PAP-M6P组(P<0.05);高浓度联合组Ⅰ型胶原、透明质酸含量显著低于RGDY对照组和各浓度PAP-M6P组(P<0.05)。结论:PAP-M6P与RGDY联合应用能显著抑制HSC表达和激活TGF-β1,并减少细胞外基质沉积。

去细胞牛颈静脉经无水氨等离子体处理接枝GRGDSPK肽实验研究

目的探讨去细胞牛颈静脉血管经氨等离子表面改性后接枝甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-赖氨酸(GRGDSPK)肽的可行性及效果。方法A组:去细胞牛颈静脉经过氨等离子预处理后与GRGDSPK肽在液相溶液中作用;B组:去细胞牛颈静脉直接与GRGDSPK肽在液相溶液中作用。连续震荡漂洗条件下,激光共聚焦显微镜观察0 h、4 h GRGDSPK肽在2组材料表面的分布特征。结果在溶液作用下,随时间延长,氨等离子处理接枝荧光GRGDSPK-FITC肽的牛颈静脉血管表面肽荧光未见丧失;而物理吸附GRGDSPK-FITC肽荧光显著丧失。结论氨等离子表面改性技术用于生物衍生材料去细胞牛颈静脉可取得良好的效果。

金振口服液氨基酸特征指纹图谱及29种氨基酸同时定量的质量控制方法研究

目的氨基酸自动分析仪建立金振口服液(JOL)氨基酸特征指纹图谱及29种氨基酸(磷酸丝氨酸、牛磺酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、肌氨酸、甘氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、α-氨基丁酸、缬氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、β-丙氨酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、3-甲基组氨酸、精氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸)同时定量的分析方法。方法采用日立855-4507型离子交换色谱柱(60mm×4.6mm,3μm);检测波长分别为570、440 nm;流动洗脱泵体积流量0.35 mL/min;衍生泵体积流量0.30 mL/min;反应柱温135℃;以柠檬酸缓冲溶液为流动相进行梯度洗脱,建立JOL氨基酸特征指纹图谱,对29个主要特征峰进行化学成分指认,运用中药指纹图谱相似度软件对16批市售制剂进行相似度评价,同时对29种氨基酸进行含量测定。结果建立了JOL氨基酸特征指纹图谱结合29种氨基酸同时定量的方法;16批市售制剂的指纹图谱与对照指纹图谱的相似度值在0.989~1.000;29种定量成分线性关系良好(R2=1.000),且平均回收率为95.71%~101.87%;16批市售制剂29种氨基酸的质量浓度分别为磷酸丝氨酸15.4572~29.3624μg/mL、牛磺酸64.4234~114.2386μg/mL、天冬氨酸19.0564~32.5490μg/mL、苏氨酸6.704 8~7.841 8μg/mL、丝氨酸22.609 4~39.382 8μg/mL、天冬酰胺61.134 0~115.456 0μg/mL、谷氨酸32.254 6~63.127 2μg/mL、谷氨酰胺5.2238~8.9532μg/mL、肌氨酸4.0810~44.0076μg/mL、甘氨酸12.4030~23.5164μg/mL、丙氨酸33.876 8~44.257 4μg/mL、瓜氨酸3.514 2~9.881 0μg/mL、α-氨基丁酸1.126 4~2.287 8μg/mL、缬氨酸11.584 6~15.469 0μg/mL、胱氨酸1.660 2~4.041 8μg/mL、异亮氨酸4.087 8~5.469 2μg/mL、亮氨酸8.295 2~11.724 0μg/mL、酪氨酸7.492 6~10.761 2μg/mL、苯丙氨酸4.856 4~9.248 0μg/mL、β-丙氨酸2.309 4~6.782 6μg/mL、β-氨基丁酸0.175 0~14.790 6μg/mL、γ-氨基丁酸17.654 4~26.621 8μg/mL、鸟氨酸42.338 4~58.172 6μg/mL、赖氨酸12.994 9~28.498 0μg/mL、组氨酸1.802 6~4.0674μg/mL、3-甲基组氨酸2.6084~4.3840μg/mL、精氨酸107.1416~301.6498μg/mL、羟脯氨酸15.8116~37.8076μg/mL、脯氨酸143.714 6~243.956 6μg/mL。结论氨基酸自动分析仪法测定JOL中氨基酸具有重现性好、结果可靠的优点;且JOL中氨基酸类成分定性定量研究在一定程度上明确了君药山羊角对制剂组方的成分贡献,为构建JOL全方位质量评价体系提供了有益补充。

RGD-TAT-KDRsiRNA慢病毒载体构建及抗肿瘤活性

目的构建精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)介导的穿膜肽(TAT)-血管内皮细胞生长因子受体(KDR)siRNA融合基因慢病毒载体,探讨其对人肺癌A549细胞的抑制效果。方法设计合成编码RGD的2条寡核苷酸链,克隆到p GC/TAT-KDR siRNA载体的TAT下游,构建TAT-RGD-KDR siRNA融合基因载体;慢病毒包装并感染A549细胞;通过Western blot和real-time PCR检测A549细胞KDR基因表达水平;通过噻唑蓝法、双色法流式细胞仪和Transwell侵袭实验检测KDR基因沉默对A549细胞凋亡和侵袭力的影响。结果测序和Blast比对证实重组载体中的RGD序列与设计一致;TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染A540细胞KDR mRNA和蛋白表达水平分别为(22.7±3.9)%和(19.3±2.7)%,明显低于TAT-KDR siRNA融合基因慢病毒载体转染组,差异有统计学意义(P<0.01);该载体具有较强的抑制A549细胞增殖、促进细胞凋亡和抑制细胞体外侵袭力的作用。结论 TAT-RGD-KDR siRNA融合基因慢病毒载体通过抑制细胞KDR mRNA和蛋白表达,抑制A549细胞增殖和侵袭、促进细胞凋亡。

PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF神经导管与骨髓间充质干细胞亲和性研究

采用全骨髓分离法分离并纯化获得了大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs),将复合材料PRGD/PDL-LA/β-TCP/NGF(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽接枝聚(羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子)与大鼠骨髓间充质干细胞复合培养之后进行扫描电镜样品制备及观察,对其细胞亲和性进行评价.结果表明,PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合材料与大鼠骨髓间充质干细胞具有良好的细胞亲和性.骨髓间充质干细胞在复合材料表面铺展良好,多数细胞呈现梭形,接近原代培养状态.

RGD均叉肽合成及其对高转移肿瘤细胞的黏附抑制作用

目的:设计并合成RGD均叉肽α-精甘天冬氨酰-ε-精甘天冬氨酰赖氨酸甲酯。方法:采用固相法合成,观察目标化合物对PG细胞和LA795细胞的黏附抑制作用。结果:总收率42%,目标化合物结构经质谱鉴定。当RGD均叉肽浓度达25μg·mL-1与肿瘤共同温育48 h开始表现黏附抑制作用,并呈一定的剂量依赖关系。结论:本实验合成的目标化合物对肿瘤细胞具有黏附抑制作用。

聚羟基脂肪酸酯的生物修饰及其生物相容性研究

目的探讨经聚羟基脂肪酸酯表面颗粒结合蛋白(polyhydroxyalkanoates granule binding protein,PhaP)-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)融合蛋白修饰后的聚羟基丁酸戊酸酯[poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate),PHBV]和聚羟基丁酸己酸酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate),PHBHHx]的亲水性及其与软骨细胞的生物相容性。方法利用溶剂挥发法制备PHBV和PHBHHx生物膜材料,扫描电镜观察材料结构;通过蛋白工程技术表达纯化PhaP-RGD融合蛋白,按照3.5 mg/mL浓度对两种生物膜材料进行蛋白修饰,通过测量接触角检测蛋白修饰前后材料表面亲疏水性的改变。采用三步消化法体外分离培养人鼻中隔软骨细胞并传代。取第2代细胞分别接种于PHBV(A1组)、PHBV/PhaP-RGD(A2组)、PHBHHx(B1组)、PHBHHx/PhaP-RGD(B2组)、细胞培养板(C组)。培养3 d后行DAPI染色观察细胞增殖情况;3、7 d通过MTT法检测细胞增殖能力;7 d扫描电镜下观察细胞在生物膜材料表面的贴附及形态结构,并通过甲苯胺蓝染色初步检测细胞外基质分泌情况。结果扫描电镜观察示PHBV和PHBHHx生物膜材料表面为多孔结构;经融合蛋白修饰后PHBV、PHBHHx生物膜材料表面接触角均显著减小,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞接种于生物膜材料表面后均能生长,培养3 d后B2组细胞增殖能力最强(P<0.05);7 d时各组软骨细胞增殖能力均较3 d增强(P<0.05),组间比较B1、B2组高于A1、A2、C组,B2组高于B1组、A1组高于A2组(P<0.05)。培养7 d,甲苯胺蓝染色示A1、A2、B1、B2组材料表面均可见蓝色异染,其中A1、A2组染色程度相似,B2组染色较B1组深;扫描电镜观察示各组细胞贴附良好,细胞之间形成连接,并伸入材料孔隙内。结论经PhaPRGD融合蛋白修饰的PHBHHx生物膜材料与软骨细胞有良好的生物相容性。

全保护RGD三肽的合成方法研究

以两条路线、多种偶联试剂 (DCC ,EDCI ,CDI ,EEDQ)合成了全保护三肽Arg Gly Asp (RGD) .Boc Arg(Tos) OH经上述偶联剂短时活化 ,于合适条件下与TsOH·Gly OBzl缩合 ,均获得良好收率 ( 4 3 %～ 97% ) .经Pd(OH) 2 /H2 还原得到的Boc Arg(Tos) Gly OH于 2 2～ 2 7℃与HCl·Asp(OcHex) OBzl偶联得到全保护三肽Boc Arg(Tos) Gly Asp(OcHex) OBzl (TM) ,反应收率分别为 76 4% (DCC/HOSu) ,64 7%～ 78 3 % (DCC/HOBt) ,66 7%～ 77 9% (EDCI/HOBt) .Boc Gly OH和HCl·Asp (OcHex) OBzl经DCC/HOBt或CDI活化 ,可得到碳端二肽Boc Gly Asp(OcHex) OBzl(收率分别为 81 2 % ,89 5 % ) ,该二肽脱Boc后与Boc Arg(Tos) OH反应 ,经DCC/HOBt,EDCI/HOBt,CDI,DCC/HOSu活化 ,均可生成目标分子TM ,其反应收率分别为 40 4% ,73 8% ,67 8% ,84 4% .

^(18)F标记正电子药物研究现状与进展

正电子发射断层显像在肿瘤受体研究中,用18F标记精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(arg-gly-asp,RGD)肽靶向肿瘤组织内新生血管内膜细胞和肿瘤细胞膜上高表达的αvβ3整合素以揭示血管生成、肿瘤生长和转移,已成为近些年研究的热点和难点,而其研究进展在一定程度上也反映了18 F标记多肽的发展历程。本文就目前国内外18F标记正电子药物的研究现状与进展进行综述。

腔内预衬在人工血管内皮化中的应用

目的 介绍腔内预衬在人工血管内皮化中的应用。 方法 收集近年相关文献并加以综合分析。 结果 腔内预衬包括:化学预衬(胶原、纤维结合素、层粘连蛋白、聚左旋赖氨酸、明胶和细胞外基质等) ,预凝(血浆、血液、血清和纤维蛋白凝胶等) ,化学结合(肝素、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸和植物凝集素)和表面修饰。大多数预衬物都能明显提高内皮细胞黏附。 结论 腔内预衬能促进人工血管内皮化,但对浓度和孵化时间还需进一步研究。

功能化离子液体为载体液相合成RGD三肽

以甲基咪唑、氯乙醇和四氟硼酸钠为原料制备了含羟基的功能化离子液体l-(2-羟乙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([2-hydemim][BF4]),并以其为液相载体,精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸为原料,探讨了液相支载合成了精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽(RGD)的新方法,最后在温和的条件下用氢氧化钠进行切割反应,得到了产率和纯度较高的RGD三肽,目标化合物不需要进一步的色谱纯化,产率为84%,纯度为98%。

含RGD序列肽及类似物的合成

二十世纪80年代初,人们已经从细胞外基质(ECM)中分离出大量的糖蛋白.大多数ECM糖蛋白在细胞粘附中起着重要作用,因此称为粘附蛋白.

量子点偶联RGD用于喉癌血管的靶向活体成像

研究了偶联环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-D-苯丙氨酸-赖氨酸[c(RGDfK)]肽段的CdSe/ZnS量子点(QDRGD)对喉癌血管靶向成像。利用羧基与氨基反应将c(RGDfK)肽段与QD偶联;采用荧光分光光度计对QD-RGD在RMPI1640培养基和小鼠血清溶液中的光谱稳定性进行了检测;利用荧光显微镜检测QD-RGD对Hep-2细胞和MCF-7细胞上整合素αvβ3的靶向性;最后将QD-RGD尾静脉注射到小鼠体内,检测了其对皮脊翼视窗中喉癌血管的靶向性。结果表明QD-RGD的发射光谱在RMPI1640培养基4h内没有明显变化,在小鼠血清中24h内发射光谱的荧光强度仅下降了20%;对细胞荧光成像表明QD-RGD能特异性与细胞表面的整合素αvβ3结合;血管成像表明QD-RGD在注射2h后聚集在喉癌局部血管,24h后QD-RGD从血管中移除。该研究表明QD-RGD能用于活体喉癌肿瘤血管靶向成像,这为喉癌的靶向诊断和靶向治疗研究提供了参考。

环状RGDs修饰的分子刷型共聚物在成像及药物运输中的应用

以具有丰富接枝侧链的阴离子型共轭聚合物分子刷PFPANa为材料,通过简单的一步修饰法在聚合物的部分接枝侧链上引入靶向配体分子c(RGDyK),并利用分子刷侧链上未修饰配体分子的羧基负离子与抗癌药物DOX静电结合,制备了基于分子刷型共轭聚合物的靶向细胞成像和载药系统.研究结果表明载药系统对DOX药物的载药量可达13.3 wt%,体外细胞实验研究结果表明该载药系统可实现对肿瘤细胞的靶向选择性成像,并显著促进了肿瘤细胞对DOX药物的摄取,具有良好的抗肿瘤细胞生长效果,显著提高了药物运输效率.