葡萄糖基转移酶在α-葡萄糖基化丁香酚生物合成中的应用

丁香酚因具有抑菌、抗肿瘤、廉价易得等特性,被广泛应用于医药、香料及调味剂等领域。但因其不稳定、易升华、水溶性差等缺点,限制了它的进一步应用。糖基化修饰可显著提高丁香酚的应用特性,本研究利用重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)p ET28a-agl A高效表达的源自野油菜黄单胞菌的葡萄糖基转移酶,生物催化丁香酚生成α-葡萄糖基化丁香酚(α-EG)。同时对其生物合成中酶催化反应性质进行了研究。结果表明其最适反应条件:pH=8.5,温度为35℃,丁香酚与麦芽糖最适浓度分别为60 mmol/L及1.2 mol/L。该酶在pH 6~8及4℃~30℃内能保持较好的稳定性。1 mmol/L金属离子Cu^(2+)能强烈抑制糖基转移酶活性,而1 mmol/L金属离子Fe^(2+)对酶的催化反应有显著的促进作用。采用最优催化条件,反应100 min,α-葡萄糖基化丁香酚(α-EG)的转化率为75%。

异丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成及热裂解转移率

以乙酰溴-α-D-葡萄糖(Ⅰ)作为糖基供体与异丁香酚(Ⅱ)进行反应,通过相转移催化法和离子液体催化法合成了异丁香酚-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ),然后在甲醇钠中脱乙酰化得到异丁香酚-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)。将化合物Ⅳ加入卷烟中,测试了其在卷烟主流烟气粒相中的转移率。结果表明,合成Ⅲ采用离子液体催化法(收率56.8%)优于相转移催化法(收率43.5%)。离子液体催化法反应条件为:1-丁基-3-甲基-溴化咪唑为催化剂、氯仿为溶剂、氢氧化钠水溶液为缚酸剂、n(Ⅰ)∶n(Ⅱ)=0.8∶1,n(Ⅰ)∶n(1-丁基-3-甲基-溴化咪唑)=1∶1、室温、反应时间8 h。在上述条件下,化合物Ⅲ的收率为56.8%。化合物Ⅲ在甲醇钠/甲醇溶液中反应脱去四乙酰基,得到化合物Ⅳ,收率87.6%。卷烟燃吸过程中,化合物Ⅳ热裂解为异丁香酚,异丁香酚向主流烟气粒相中的转移率为3.2%。

玉米丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶基因bx12的克隆及其原核表达

为阐明丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶在玉米抗蚜和抗螨中的作用,该研究以4个对蚜虫和叶螨抗性不同的玉米自交系为材料,克隆编码丁布葡萄糖苷-4-羟基甲基化酶的基因bx12,并进行了原核表达。结果表明:除自交系Mo17-476M外,其余3个自交系B73、ZaC546和Mo17-476W的基因组中都分离到含有由744个碱基所构成的bx12基因开放阅读框的目标DNA片段,都编码由247个氨基酸组成的同一种蛋白BX12P;该蛋白与参考基因编码的蛋白氨基酸序列的一致性为100%。生物信息学分析表明,BX12P是一种多功能酶,属于依赖于S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的邻-甲基转移酶结构域超级家族,具有蛋白质二聚化功能、植物甲基转移酶功能和邻-甲基转移酶功能;该酶具有专一性地将丁布葡萄糖苷转化为4-甲氧基丁布葡萄糖苷的功能。利用克隆的bx12基因所构建的原核表达载体,经测序和通读结构鉴定,在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功表达出了目的蛋白。

槲皮素-3-O-葡萄糖苷抑制α-乳白蛋白非酶糖基化机制分析

以牛α-乳白蛋白(bovineα-lactalbumin,α-La)和果糖为非酶糖基化模型,分析槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-β-D-glucuronide,Q3G)对α-La非酶糖基化过程中果糖胺和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)形成及游离氨基含量和褐变度的影响,然后结合分子对接和质谱鉴定技术进一步揭示其对非酶糖基化的抑制机理。结果表明:Q3G能显著减轻糖基化过程中的褐变程度,增加游离氨基含量,抑制果糖胺和5-HMF的形成,延缓糖基化反应的进程,且Q3G添加量为2 mmol/L时效果最好。分子对接结果表明Q3G可通过氢键、范德华力和疏水相互作用与α-La的活性氨基酸残基进行结合,影响α-La和果糖的糖基化反应,缓解糖基化反应的进程。同时,超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱分析也发现Q3G屏蔽了糖基化的潜在活性位点Lys93和Lys108,且新增糖基化位点Lys98的糖基化活性较弱,可达到抑制非酶糖基化的作用。本研究可为Q3G作为潜在抗糖基化剂的开发提供理论基础。

GnT-IVa对京尼平苷调节胰腺β细胞GLUT2糖基化及葡萄糖摄取的影响

N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-4a(N-acetylglucosamine transferase-4a,GnT-IVa)是胰岛β细胞中葡萄糖转运蛋白2(glucose transporter 2,GLUT2)形成N-糖链分支复合物、使其驻留在细胞膜表面完成正常生理功能所必需的糖基转移酶。课题组前期研究发现,京尼平苷可快速调节胰腺β细胞中GLUT2糖基化和葡萄糖摄取,但GnT-IVa是否与其有直接的联系,还有待研究。首先利用siRNA干扰INS-1细胞GnT-IVa表达,随后分析京尼平苷对GLUT2糖基化、葡萄糖摄取、代谢以及葡萄糖诱导胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的影响。结果证实,在GnT-IVa干扰的INS-1细胞中,京尼平苷对GLUT2糖基化的影响、葡萄糖吸收、ATP生成以及GSIS被明显抑制。研究结果提示,GnT-IVa可能在京尼平苷调节胰岛β细胞GLUT2糖基化、葡萄糖摄取、代谢和GSIS过程中有重要作用。

丁香酚和异丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成

以丁香酚和异丁香酚以及α-D-溴代四乙酰基葡萄糖为原料,用NaOH水溶液与丙酮的混合溶剂进行丁香酚-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷和异丁香酚-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖苷的合成,然后用K2CO3/CH3OH进行脱乙酰基反应,最后得到丁香酚和异丁香酚-β-D-葡萄糖苷,反应总得率为36.8%,产物的结构经IR,1HNMR,13CNMR证实。

马铃薯类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因的克隆与表达分析

根据茄科植物花色苷生物合成相关基因的资料,设计简并引物,通过RT-PCR的方法从马铃薯(Solanum tuberosumcv.Chieftain)紫色芽的cDNA中克隆到类黄酮-3-O-葡萄糖基化酶基因(3GT)的全长cDNA。序列分析表明,这个3GT基因编码的多肽为448个氨基酸残基,在氨基酸水平上与茄科的矮牵牛和茄子的一致性最高,均为76%,多重比较和系统发育分析均表明,该基因为3GT家族中的一个新成员。用半定量RT-PCR进行了表达分析表明,3GT在根、叶和块茎中的表达量远高于茎和花;此外,3GT在Chieftain的红色愈伤组织中表达而在非红色愈伤组织中不表达,可见,3GT的表达与花色苷的积累是相关的。

添加中药的鸡腿蘑发酵液对α-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制作用

在鸡腿蘑发酵培养基中添加不同中药进行液体培养,比较对α-葡萄糖苷酶及非酶糖基化的抑制率。结果表明,添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液的抑制率最高,分别为(41．6±1．1)％和(97．0±0．3)％。以四氧嘧啶诱发的糖尿病小鼠模型进行降血糖试验,结果表明添加苦瓜的鸡腿蘑发酵液有显著降血糖作用。

糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的热稳定性

以N-糖基化提高毕赤酵母重组表达β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的热稳定性为目的,在PGUS-P模拟结构分析的基础上,半理性方法设计并通过定点突变引入具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的新N-糖基化位点,经毕赤酵母重组表达后,获得了3个新糖基化的突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259。反应动力学分析表明,与原始PGUS-P相比,突变酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259催化甘草酸水解的Km变小,Kcat/Km增加,表明其对底物甘草酸的亲和力和催化效率均得到提高。热稳定性分析表明,PGUS-P-35和PGUS-P-259的热稳定性得到改善,在65℃下保温90 min,其热稳定性相对PGUS-P分别提高了13%和11%。研究表明在蛋白质的合适位点引入糖基修饰对提高蛋白的热稳定性具有促进作用。

丁香精油抗LDL糖基化活性及其主要成分—丁香酚与牛血清白蛋白的相互作用

实验室前期研究结果表明,在国家规定的药食两用物品名单中,丁香抗氧化活性最强。前人发现天然产物的抗氧化功能与抗糖基化活性息息相关。因此,目的是在此基础上进一步对丁香精油(clove essential oil,CEO)的抗糖基化活性及其中含量最高的组分—丁香酚(Eugenol)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的相互作用进行研究。在低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的非酶糖基化孵育体系中,光谱测定结果表明CEO对LDL糖基化早期、中期和末期产物的生成均具有显著的抑制效果,且对末期产物的抑制作用最强。采用气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)对CEO分析发现,CEO中含量最多的组分是丁香酚。通过多光谱和分子对接对丁香酚与BSA的相互作用研究发现,紫外-可见(ultraviolet-visible,UV-Vis)光谱表明丁香酚与BSA之间存在相互作用;在荧光发射光谱中,随着丁香酚浓度增加,BSA的荧光强度逐渐增强且发生蓝移,进一步证明了二者之间存在相互作用。通过计算不同温度下的结合常数发现,丁香酚与BSA产生相互作用过程中有热力学过程参与,热力学参数和位点标记竞争试验表明丁香酚通过氢键和范德华力与BSA在位点Ⅰ结合。随着丁香酚浓度增加,丁香酚与BSA混合体系的同步荧光(synchronous fluorescence,SF)、三维荧光(three-dimensional,3D)和傅里叶变换红外(Fourier transform infrared,FTIR)光谱的信号强度在发生变化的同时也发生了位移,表明丁香酚的添加使BSA构象发生了改变。通过分子对接技术进一步验证了丁香酚与BSA间相互作用的试验结果。该研究为丁香进一步开发应用提供理论支持。

O-N-乙酰葡萄糖胺糖基化水平正调控促血管生成素-2表达从而促进小鼠肝癌中肿瘤新生血管形成

目的探索在肝癌的发生发展过程中,O-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化水平与促血管生成素-2(Ang-2)表达的关系.方法采用二乙基硝胺(DEN)诱导C57BL/6小鼠肝癌模型,检测O-GlcNAc糖基化、Ang-2及内皮细胞黏附分子(CD31)在肝癌中表达;采用N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)抑制剂及N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)抑制剂干预HepG2细胞,检测Ang-2的表达是否随O-GlcNAc糖基化水平的变化而改变;采用MTr检测O-GlcNAc糖基化的水平与肝癌细胞增殖的关系;采用Transwell法检测HUVEC细胞中O-GlcNAc糖基化水平与细胞迁移侵袭能力的关系.结果在DEN诱导的肝癌模型中,小鼠肝脏体积明显增大,肝脏上可见大小不一的肿瘤.免疫组织化学结果显示,与对照组相比,O-GlcNAc糖基化水平与Ang-2的表达在模型组小鼠肝脏中均明显上升(P<0.05),且肝癌组织中CD31染色的微血管密度明显上升(P<0.01);qRT-PCR检测结果显示,通过检测OGT、OGA、Ang-2 mRNA水平,得出O-GlcNAc糖基化水平影响Ang-2的表达水平;Western blotting结果显示,采用OGT抑制剂干预HepG2细胞后,Ang-2的表达随着O-GlcNAc糖基化水平的降低而下调;采用OGA抑制剂干预HepG2细胞后,Ang-2的表达随着O-GlcNAc糖基化水平的上升而升高.MTT结果显示,O-GlcNAc糖基化水平与肝癌细胞的增殖有密切关系,当O-GlcNAc糖基化水平高时,肝癌细胞增殖能力较强,当O-GlcNAc糖基化水平较低时,肝癌细胞的增殖能力明显受到抑制.Transwell结果显示,HUVEC细胞迁移侵袭能力与O-GlcNAc糖基化水平呈正相关.结论在肝癌的发生发展过程中,O-GlcNAc糖基化水平逐渐上升,且Ang-2的表达水平受到O-GlcNAc糖基化的正调控,从而促进肿瘤新生血管的生成.

酶催化直接糖基化制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷

研究了水-有机溶剂体系中β-葡萄糖苷酶催化直接糖基化反应制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷,考察了反应体系、水分活度(a_w)、反应温度和β-D-葡萄糖与p-羟基苯乙醇摩尔比对酶稳定性及产率的影响。实验结果表明,在水-乙腈、水-1,4-二氧六环和水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中均可进行直接糖基化反应。在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中,合适的反应条件为p-羟基苯乙醇0.6 mol/L,β-D-葡萄糖0.2 mol/L,酶量3.6 mg/10 mL,a_w为0.76,52℃,pH值6.2,280 r/min,反应26 h后产率达到20.66%。随反应时间增加,产物抑制和酶稳定性降低程度明显增加,限制了产率的提高。

氨基化硅胶固定化葡萄糖氧化酶的研究

利用溶胶 凝胶技术 ,以四甲氧基硅 (TMOS)和γ 氨丙基甲基二甲氧基硅烷 (APMDMOS)为前驱体制成了一种功能化的材料———氨基化硅胶 .并以戊二醛为交联剂 ,利用该氨基化硅胶为载体对葡萄糖氧化酶(GOD)进行交联固定化 ,研究了TMOS用量、戊二醛浓度、给酶量、温度和 pH值等因素对固定化GOD活力的影响 ,并考察了固定化GOD的热稳定性和贮存稳定性 .红外光谱验证了氨基化硅胶交联固定化GOD的可行性 .确定出了优化的固定化条件 :TMOS用量为 10 % ,戊二醛的浓度 2 0 % ,给酶量 16 0 0U ,最适 pH和最适温度分别为 5 2和 32℃ .

酶催化制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷过程强化

以亲水性固体材料吸附p-羟基苯乙醇的形式以及补加葡萄糖方式,通过β-葡萄糖苷酶在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中催化p-羟基苯乙醇直接糖基化反应制备p-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷。当硅藻土吸附p-羟基苯乙醇的吸附量为0.06mol·g-1,体系水分活度(aW)0.78,52℃,pH6.2时,在p-羟基苯乙醇为0.6mol·L-1,与葡萄糖摩尔比为3的条件下,反应24h,反应产率达25.63%,产物浓度为0.051mol·L-1;采取反应后期补加葡萄糖到初始浓度,继续反应24h,总反应产率达40.15%,产物总浓度为0.101mol·L-1。而两次补加的总反应产率达41.10%,产物总浓度为0.124mol·L-1。实验结果表明,吸附形式p-羟基苯乙醇和补加葡萄糖两种方式对在水-1,2-二乙酰氧基乙烷体系中的酶催化直接糖基化反应过程都具有明显的强化作用。

2-脱氧葡萄糖在抗肿瘤领域的研究进展

2-脱氧葡萄糖(2-Deoxyglucose,2-DG)被证明对多种肿瘤细胞有抑制作用其作为可能的抗肿瘤药物的研究已有近半个世纪一系列的研究显示2-脱氧葡萄糖有较复杂的抗肿瘤机制。除了对糖酵解的抑制,降低细胞内ATP,抑制生长以外,它还抑制寡糖链来干扰肿瘤的糖基化,引起细胞内的未折叠蛋白反应和凋亡,或影响糖基化来抑制相关转录因子。在单独使用时,可激活某些肿瘤的凋亡通路和因子,造成细胞凋亡,尚可影响氧化还原反应,抑制肿瘤生长。联合使用时,它被证实在体外对放化疗有增敏作用,还可减少化疗药物造成的机体损伤动物实验和部分Ⅰ期临床研究,证实2-脱氧葡萄糖具有代谢快、不良反应小的特点但国内对2-脱氧葡萄糖的相关研究以及重视程度尚不足本文回顾了2-脱氧葡萄糖的抗肿瘤机制和研究现状。

3-脱氧葡萄糖醛酮体外生成AGEs模型的建立

目的:建立可用于药物筛选的体外蛋白质非酶糖基化模型。方法:37℃孵育1周后用流动注射法于波长(λ:Ex/Em):370/440 nm处测定糖基化终产物(AGEs)。结果:反应1周后,反应体系内3-脱氧葡萄糖醛酮(3- DG)浓度与AGEs的吸收度值呈线性关系,y=22.946x+22.846;r^2=0.998 5。结论:随着各反应体系中底物3-DG浓度的增加及反应时间的延长,蛋白质非酶糖基化反应增强3-DG为底物与牛血清白蛋白组成反应系统,能较可靠地反映AGEs的生成变化,有望成为体外蛋白质非酶糖基化的1种新模型。

3,6-(二甲氨基)-二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐对AGEP引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及牛主动脉内皮细胞内皮素和一氧化氮改变的影响(英文)

目的 :观察 3 ,6 (二甲氨基 ) 二苯骈碘杂六环葡萄糖酸盐对AGEP引起的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖及牛主动脉内皮细胞内皮素和一氧化氮改变的影响。方法 :采用牛血清白蛋白 (BSA)与不同浓度葡萄糖 (0 ,2 0 ,5 0 ,80mmol·L-1)体外孵育制备糖基化终产物 (AGEP) ,应用 [3 H] TdR掺入法和MTT比色法观察I-93对重度糖化的AGEP诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞 (ASMC)增殖的影响 ;应用放射免疫技术及Greiss法观察I -93对AGEP引起的牛主动脉内皮细胞 (BAEC)释放内皮素 1(ET 1)和一氧化氮 (NO)的影响。结果 :I-93 10 -7～ 10 -5mol·L-1能明显抑制AGEP引起的ASMC增殖 ,其 [3 H] TdR掺入量和MTT比色法的最大抑制率分别为79 .4%和 44 .2 %。随AGEP糖浓度的增加 (2 0～ 80mmol·L-1) ,BAEC培养液中ET 1含量亦逐渐上升 [(4 93± 63 )～ (779± 10 5 )ng·L-1] ,I -93 10 -7～ 10 -5mol·L-1能明显抑制重度糖化的AGEP促进ET 1释放的作用 ;I -93对AGEP灭活NO的作用有剂量依赖性抑制效应。结论 :I -93有抑制ASMC增殖的作用 ;对AGEP诱导的BAEC释放ET 1和NO间平衡失调有调节作用 ,在防治阻塞性血管疾病方面I

纤维素载体固定化β-葡萄糖苷酶及其在大豆异黄酮水解中的应用

建立纤维素载体固定化β-葡萄糖苷酶系统,用于黑豆浆中大豆异黄酮去糖基化反应,并对该催化系统进行了可行性评价。结果表明,在40 cm3纤维素颗粒上可结合超过40 mgβ-葡萄糖苷酶,并且能有效将4-硝基苯-β-D-葡糖苷酸水解成对硝基苯酚,其反应最适温度为50℃。经动力学测试后可得其米氏常数Km值为(1.38±0.20)mmol/L。将该固定化酶系统用于黑豆浆中大豆异黄酮去糖基化,通过高效液相色谱检测其转化效率,表明该系统可以在30 min内利用40 cm^3含酶载体将50 mL黑豆浆中的异黄酮全部转化为去糖基化形式。该固定化酶催化系统连续化催化稳定性实验表明,在经过15次反应以及15 d之后,该固定化酶系统仍然可维持其60%的催化活性。

2-氰基苄基诱导的葡萄糖醛酸β糖苷键立体选择性

以2,3-O-(2-氰基苄基)-4-O-氯乙酰基-β-对甲基苯基-D-葡萄糖醛酸硫苷等7个单糖模块作为糖基供体,以甲醇等醇类化合物作为糖基受体,分别在二氯甲烷和甲苯溶剂中进行了糖基化反应,研究了葡萄糖醛酸C2位引入2-氰基苄基(BCN)以及溶剂效应对糖苷键α/β选择性的影响.通过对糖基产物的1H NMR,13C NMR和HSQC等谱图分析发现, BCN可以有效提高糖苷键的β选择性,其中部分糖基化产物的糖苷键α/β比例最高可达1/50.为磺达肝癸钠分子中葡萄糖醛酸的β糖苷键的构建方法做出了初步探索.

丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成、热裂解及其在卷烟中的应用

为了掌握丁香酚-β-D-葡萄糖苷在卷烟中的应用情况,对所合成的丁香酚-β-D-葡萄糖苷进行热失重及热裂解-气相色谱-质谱(Py-GC-MS)分析;将丁香酚-β-D-葡萄糖苷添加至卷烟中,考察其加香应用效果,采用GC-MS考察其在卷烟主流烟气中的释放行为。结果表明:①丁香酚-β-D-葡萄糖苷的热稳定性相比丁香酚明显提升。②丁香酚-β-D-葡萄糖苷在约220℃开始发生裂解,热裂解的主要产物为丁香酚,其他产物有糠醛、苯酚和2-甲氧基苯酚等。③添加丁香酚-β-D-葡萄糖苷的卷烟烟气能释放丁香酚,且其释放量随糖苷添加量的增加而增加,具有良好的释香稳定性和均匀性,糖苷在卷烟中应用的添加方式不同可达不同的加香效果。丁香酚-β-D-葡萄糖苷可作为一种稳定的烟用香料前体应用于卷烟加香中。