大肠杆菌中三酶耦联合成α-酮异戊酸

α-酮异戊酸是生物合成和化学合成领域中重要的中间体,在医药和化学合成领域中具有广泛的研究和应用价值。将α-酮异戊酸合成途径中的乙酰乳酸合成酶、乙酰乳酸异构还原酶、二羟基酸脱水酶3种关键酶编码基因BsalsS、EcilvC、EcilvD克隆于pETDuet-1载体上,在E.coli BL21(DE3)中加强α-酮异戊酸的合成途径,获得出发菌株SDC。进一步优化3个关键酶基因在质粒上的排列顺序,并分别在基因后添加终止子,通过比较菌株粗酶液催化丙酮酸钠底物合成α-酮异戊酸产物的能力,获得了菌株CTSDT,其α-酮异戊酸合成量比菌株SDC提高了2.28倍。菌株CTSDT以葡萄糖为碳源发酵16 h后,α-酮异戊酸产量达到1.70 g/L,是改造前菌株SDC的3.36倍。研究结果为大肠杆菌中α-酮异戊酸的高效发酵合成奠定了基础。

以葡萄糖为原料结合生物发酵与化学合成制备酮泛解酸

D-泛酸(维生素B5)是一种重要的维生素,在饲料、化妆品和制药行业均有广阔的市场。酮泛解酸是泛酸生物合成途径的中间体,易内酯化为酮基泛解酸内酯,后者可立体选择性地转化为D-泛解酸,并进一步用于D-泛酸的生产。本工作提供了一种采用α-酮基异戊酸与甲醛经羟醛反应合成酮泛解酸的新方法。其中,反应物α-酮基异戊酸可由葡萄糖原料经发酵法生产。结果表明,以葡萄糖为碳源,经克雷伯氏肺炎杆菌发酵能高水平生产D-泛酸生物合成途径的关键前体—α-酮基异戊酸。采用商品α-酮基异戊酸开发一种新型的酮泛解酸合成方法;分析合成反应机理,确定总反应级数为1.87;经条件优化确定酮泛解酸合成反应的最佳pH=13,最佳温度为45℃,此条件下酮泛解酸转化率达83.5%。调节酮泛解酸溶液pH至强酸性,有助于其内酯化合成酮基泛解酸内酯。之后采用前述优化的方法,由流加发酵制备的25.2 g/Lα-酮基异戊酸合成酮泛解酸19.9 g/L。最后通过异丁醇萃取、活性炭脱色、浓缩结晶方法进行产物提纯,调节酮基泛解酸内酯溶液pH在7~10范围内可使其开环转化回酮泛解酸。最终得到酮泛解酸及其内酯的纯品。本研究建立了以葡萄糖为原料通过α-酮基异戊酸中间体生产酮泛解酸的方法。该方法结合生物发酵和化学合成过程,采用廉价原料,具有绿色高效的特点,有望用于工业化生产泛酸。