α-酮戊二酸脱氢酶复合物在缺血性脑卒中后的适应性再灌注中的保护作用研究

目的:研究α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-KGDHC)在大鼠缺血性脑卒中后的适应性再灌注中的保护作用,且探讨其作用机制。方法:建立脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型,TTC染色后使用成像软件计算缺血后的脑梗死体积。化学方法检测α-KGDHC活性,评估α-KGDHC活性随脑缺血时间的变化趋势,并比较普通再灌注组和适应性再灌注组的差异;用CoCl 2处理大鼠神经母细胞瘤细胞B35和人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y模拟细胞缺氧,用E1K siRNA抑制α-KGDHC活性,Western blot检测凋亡抑制蛋白Bcl-2,促凋亡蛋白Bax和Caspase 3的表达变化。结果:在MCAO模型中适应性再灌注较普通再灌注进一步减少了脑梗死体积(P<0.05),凋亡蛋白Caspase 3表达量降低;大脑皮层和海马脑组织中α-KGDHC活性随着缺血时间延长而降低(P<0.05),适应性再灌注抑制了α-KGDHC活性衰减的速率(P<0.05)。通过干扰α-KGDHC的组分E1K可以抑制Bcl-2的表达(P<0.05),促进Bax的表达(P<0.05)和Caspase 3的表达(P<0.05)。结论:研究表明,α-KGDHC是脑缺血后适应性再灌注脑保护作用的重要因子,其发挥脑保护作用可能与抑制凋亡通路的活化有关。

低温对脑缺血-再灌注大鼠α-酮戊二酸脱氢酶复合物活性及脑梗死体积的影响

目的观察不同温度下脑缺血-再灌注大鼠线粒体α-酮戊二酸脱氢酶复合物(α-KGDHC)活性及脑梗死体积的变化,进一步探讨不同低温的神经保护机制。方法取雄性SD大鼠35只,按随机数字法分为假手术组(n=5)及大脑中动脉闭塞2h再灌注组(n=30),后者根据再灌注时温度的不同,再分为37℃、33℃及28℃组(n=10)。采用线栓法制备脑缺血-再灌注大鼠模型,再灌注时利用降温毯降温,使肛温分别保持37℃、33℃及28℃,时间为3 h。在缺血后24h时检测各组大鼠双侧大脑皮质和海马区线粒体α-KGDHC活性及脑梗死体积。结果①假手术组、37℃组、33℃组、28℃组缺血侧皮质α-KGDHC分别为(20.1±1.3)、(9.5±0.9)、(15.2±1.1)、(5.5±1.2)mU/mg(蛋白);海马区为(17.1±1.1)、(8.1±1.1)、(12.2±1.0)、(4.1±1.1)mU/mg(蛋白)。33℃组与37℃组和28℃组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。②37℃组脑梗死的体积最大,占对侧大脑半球的(48.2±1.1)%,33℃组梗死体积最小,占(31.6±1.3)%,28℃组占(34.8±1.2)%,三组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论提高缺血-再灌注大鼠线粒体α-KGDHC活性是低温干预的神经保护作用机制之一。33℃低温比28℃低温有更好的效果。

磁共振波谱评估2-羟基戊二酸在胶质瘤异柠檬酸脱氢酶基因突变的研究意义

目的:基于磁共振波谱检测2-羟基戊二酸(2HG)在异柠檬酸脱氢酶(IDH)基因突变状态的胶质瘤中的研究价值。方法:收集2021年1月—2022年6月在佛山市第一人民医院术后病理诊断为胶质瘤的患者21例,男性13例,女性8例,年龄27~73岁,中位年龄44岁,平均年龄46.2岁,病理分型:IDH基因突变组和IDH基因野生组,低级别胶质瘤组(Ⅰ~Ⅱ级),高级别胶质瘤组(Ⅲ~Ⅳ级)。所有患者扫描方案:MR平扫加增强及MRS。患者的IDH基因突变,采用Mann-Whitney U检验分析IDH基因突变组与IDH基因野生组间的2HG的差异,胶质瘤分级与IDH基因突变的相关性采用Spearman等级相关检验。结果:IDH基因野生组:14例,IDH基因突变组:7例,低级别胶质瘤组(Ⅰ~Ⅱ级):12例,高级别胶质瘤组(Ⅲ~Ⅳ级):9例。IDH基因突变组的2HG蓄积浓度为1.34(1.21,1.42)mmol/L,IDH基因野生组的2HG蓄积浓度为0.00(0.00,0.00)mmol/L。IDH基因野生组及突变组间2HG蓄积浓度差异有统计学意义(P<0.001),对鉴别诊断的灵敏度和特异度也最高,分别为85.7%、81.4%。IDH基因突变组2HG蓄积浓度与胶质瘤分级有一定的负相关性(rS=-0.545,P<0.001)。结论:2HG可预测IDH基因突变状态,对不同级别胶质瘤无创评估。

高湿环境对大鼠肝脏异柠檬酸脱氢酶及α-酮戊二酸脱氢酶的影响

目的观察高湿环境对肝脏异柠檬酸脱氢酶（IDH）与α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDHc）含量的影响。方法32只sD大鼠按随机数字表法分为常温常湿对照组及高湿环境20、30、40d组，每组8只大鼠。采用人工气候箱模拟高湿环境，条件设置为温度25℃、相对湿度90％～95％RH。实验组大鼠每天置于箱中10h，其余时间与常温常湿对照组饲养于清洁环境（温度22～26℃，相对湿度40％～60％RH）。动物模型制作完成后，取腹主动脉血及肝组织，酶联免疫法（EusA）检测肝脏组织IDH及α-KGDHc，比色法检测血清乳酸含量，并行肝组织HE病理切片观察。结果高湿环境20d组，肝脏IDH、α-KGDHc及血清乳酸含量较常温常湿对照组无显著变化。高湿环境30、40d组，肝脏IDH含量分别降至常温常湿对照组的75.98％和79.90％（P〈0.05），α-KGDHc含量分别降至常温常湿对照组的80.00％和81.01％（P〈0.05）。血清乳酸含量较常温常湿对照组分别升高了34.58％和23.33％（P〈0.01）。病理切片显示高湿环境40d大鼠肝脏点状坏死灶增多。结论高湿环境可致大鼠肝脏组织IDH、α-KGDHc含量降低，血乳酸升高，机体有氧代谢功能不足。

α-酮戊二酸半醛脱氢酶的定点突变及酶学性质变化

3-HP是一种性质优良的化学中间体,以甘油为底物生产3-HP的研究备受青睐,而限制3-HP产量的主要原因是Ald H活力过低。对源于Azospirillam brasilense的α-酮戊二酸半醛脱氢酶(KGSADH)基因同源建模和结构分析,采用定点突变方法得到高活力KGSADH,将突变酶表达纯化,探讨酶学性质的变化。结果表明,TU-KGSADH(E120D/P219A)酶活力达6.03U/mg,比原始酶比酶活提高了322%,最适温度由35℃降低为30℃,且热稳定性降低,最适p H为8.0,在p H 6.0-8.0条件下酶活力有所提高。Zn^(2+)对KGSADH的酶活有较强的抑制作用,而Co^(2+)、Fe^(3+)、Fe^(2+)对KGSADH的酶活有较大的激活作用。在酶的动力学方面,TU-KGSADH对乙醛的K_m由7.58降为6.28 mmol/L,V_(max)由10.6提高为12.3 U/mg。对酶学性质改变的因素分析发现,120位突变与最适p H下降和p H稳定性向酸性偏移有关,219位突变可能是最适温度和热稳定性降低的原因,为醛脱氢酶进一步定向改造提供参考。

创伤性脑损伤大鼠脑组织中α-酮戊二酸脱氢酶的活性变化及意义

目的探讨创伤性脑损伤(TBI)大鼠脑组织中α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDHC)活性变化及意义。方法将80只Sprague Dawley大鼠随机分为假手术组、TBI组、TBI-溶剂对照组、TBI-3-甲基-2-氧基戊酸(KMV)组,每组20只。TBI组、TBI-溶剂对照组和TBI-KMV组大鼠建立中度液压TBI模型,假手术组大鼠给予相同的手术步骤,但不实施液压冲击。TBI前24 h,TBI-KMV组大鼠侧脑室注射10μL KMV,TBI-溶剂对照组大鼠侧脑室注射10μL生理盐水,注射速度为lμL·min^-1;假手术组和TBI组大鼠侧脑室不做注射。分别于TBI后24、72 h及7 d时,每组随机选取5只大鼠,采用Shapira和Wahl脑损伤神经功能评分法进行神经功能评分,Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆功能;Morris水迷宫实验后快速断头处死大鼠,完整取出脑组织,迅速分离出损伤侧大脑皮层、海马及丘脑,采用比色法检测脑组织中α-KGDHC活性。TBI后72 h,每组随机选取5只大鼠,应用40 g·L^-1多聚甲醛溶液灌注固定,断头取脑组织,采用Fluoro-Jade染色液对坏死神经元进行染色并计数。结果TBI后24、72 h及7 d,TBI组和TBI-溶剂对照组大鼠神经功能评分显著低于假手术组(P<0.05),TBI-KMV组大鼠神经功能评分显著低于TBI-溶剂对照组和TBI组(P<0.05),TBI-溶剂对照组与TBI组大鼠神经功能评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。TBI后24、72 h及7 d,TBI组和TBI-溶剂对照组大鼠登台时间及登台累计距离显著长于假手术组(P<0.05),TBI-KMV组大鼠登台时间及登台累计距离显著长于TBI-溶剂对照组和TBI组(P<0.05),TBI-溶剂对照组与TBI组登台时间及登台累计距离比较差异无统计学意义(P>0.05)。TBI后24、72 h及7 d,TBI组和TBI-溶剂对照组大鼠损伤侧大脑皮层、海马及丘脑组织中α-KGDHC活性显著低于假手术组(P<0.05),TBI-KMV组大鼠大脑皮层、海马及丘脑组织中α-KGDHC活性显著低于TBI组和TBI-溶剂对照组(P<0.05),TBI-溶剂对照组与TBI组大鼠大脑皮层、海马及丘脑组织中α-KGDHC活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。TBI后72 h,TBI组和TBI-溶剂对照组大鼠损伤侧大脑皮层、海马和丘脑坏死神经元数显著多于假手术组(P<0.05),TBI-KMV组大鼠损伤侧大脑皮层、海马和丘脑坏死神经元数显著多于TBI组和TBI-溶剂对照组(P<0.01),TBI组与TBI-溶剂对照组大鼠损伤侧大脑皮层、海马和丘脑坏死神经元数比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论TBI大鼠脑组织中α-KGDHC活性降低,抑制α-KGDHC活性可加重脑损伤,α-KGDHC可能参与了TBI和继发性脑损伤的发生与发展。

桥联黄素再生NAD^(+)耦联L-谷氨酸脱氢酶高效产α-酮戊二酸

在L-谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.3,L-GluDH)催化L-谷氨酸氧化脱氨过程中涉及昂贵的氧化型烟酰胺辅因子NAD^(+),因此需要构建其再生体系以降低成本。通过构建桥联黄素(F4)耦联L-谷氨酸脱氢酶催化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸(α-KG)的新型均相体系,桥联黄素能高效氧化天然还原型烟酰胺辅因子NADH至其氧化态NAD^(+),从而减缓NADH对L-谷氨酸脱氢酶的抑制,提高α-KG产率的同时降低NAD^(+)用量。通过单因素考察,筛选得到来自艰难梭菌的L-谷氨酸脱氢酶作为酶源,在Tris-HCl缓冲液环境下进行氧化脱氨反应,结合响应面法(RSM)确立了最佳反应条件:NAD^(+)浓度1 mmol/L,F4浓度1 mmol/L,pH 8。在底物L-谷氨酸15 mmol/L条件下放大反应,24 hα-KG的收率达到92%。

Ⅰ型辅酶脱氢酶1α亚复合物4过表达对人结直肠癌细胞上皮-间质转化的作用

目的Ⅰ型辅酶脱氢酶1α亚复合物4(NDUFA4)在人结直肠癌发生中的作用和机制尚未阐明。文中旨在探讨NDUFA4过表达对人结直肠癌细胞上皮-间质转化(EMT)的作用。方法将p-NDUFA4重组质粒(p-NDUFA4组)和空载对照质粒(对照组)体外分别瞬时转入人结直肠癌HCT116细胞;利用Real-timePCR和Western blot 检测各组细胞中 NDUFA4 的表达;划痕实验、Transwell 小室迁移实验检测细胞的迁移能力变化;实时荧光定量 PCR 法检测 MMP2、MMP9、CXCR4 等表达;Western blot 检测 Twist、Snail、E-cadherin 等表达;免疫荧光法检测细胞中 E-cadherin 和 Vimentin 蛋白的表达。结果p-NDUFA4组 NDUFA4-mRNA、NDUFA4蛋白相对表达量[(1.94±0.08)%、(1.07±0.12)%]较对照组([ 0.96±0.15)%、(0.6±0.05)%]明显上调(P<0.05)。p-NDUFA4 组细胞的体外迁移能力、细胞迁移率([ 54.36±4.08)%、(1.85±0.10)%]较对照组([ 29.51± 3.17)%、(0.99±0.12)%]明显升高( P<0.01)。p-NDUFA4 组肿瘤细胞转移相关因子 MMP2、MMP9、CXCR4、间质标志物 N-cadherin、Vimentin,及转录相关因子 Snail、Twist 的 mRNA 表达较对照组显著上调,上皮标记分子 E-cadherin mRNA 明显下调(P<0.01)。结论过表达NDUFA4能明显促进人结直肠癌细胞EMT的发生。

膜联蛋白5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-羟基类固醇脱氢酶表达的影响

目的先前研究发现促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)刺激Leydig细胞后,膜联蛋白5(annexin 5)及睾酮水平同时增加,推测annexin 5和睾酮之间可能存在某种内在的联系,3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)是间质细胞的标记酶。文中旨在研究annexin 5对大鼠睾丸间质细胞睾酮分泌及3β-HSD表达的影响。方法原代培养大鼠睾丸间质细胞,用不同浓度的annexin 5(0、10-10、10-9、10-8mol/L)处理间质细胞24h和用10-9mol/L的annexin 5处理细胞不同时间(6、12、24、36h),收集培养液,用化学发光法测定培养液中的睾酮含量;Western blotting方法分析睾丸间质细胞中3β-HSD的表达变化。结果不同浓度的annexin 5处理间质细胞24h后,与对照组比较,终浓度为10-10mol/L和10-9mol/L时,睾酮水平分别升高了18%[(14.38±0.30)nmol/Lvs(12.12±0.74)nmol/L](P<0.01)和26%[(15.25±0.47)nmol/Lvs(12.12±0.74)nmol/L](P<0.01);浓度为10-8mol/L时,睾酮水平虽也有升高趋势,但无显著性差异;而Western blotting结果显示,浓度为10-9mol/L时,3β-HSD表达量升高了63%(2.19±1.00vs1.34±0.19,P<0.05),浓度为10-10mol/L和10-8mol/L时,3β-HSD表达量无显著性差异;睾酮分泌与3β-HSD的表达呈显著正相关(r=0.430,P<0.05)。10-9mol/L的an-nexin5处理细胞不同时间,与对照组相比,6h和12h后睾酮的分泌虽有升高,但无统计学意义(P>0.05);24h后睾酮的分泌量显著升高了18%[(12.59±0.41)nmol/Lvs(10.70±0.09)nmol/L](P<0.01);而处理36h后,睾酮分泌量下降了21%[(14.44±1.65)nmol/Lvs(17.46±0.31)nmol/L](P<0.01)。结论在大鼠睾丸间质细胞中,annexin 5对睾酮分泌具有调节功能且呈剂量和时间依赖性;3β-HSD是该调节过程中的关键酶之一。

睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达

从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析和测序 ,鉴定出正确的重组质粒 pET 15b .将重组pET 15b转化入宿主菌E .coliBL2 1(DE3) pLysS中 ,用硫代半乳糖苷 (IPTG)进行诱导表达 .提取细菌总蛋白质进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析并测定酶活性 .粗提物中酶活性高达 2 4 5× 10 5U/L .利用重组蛋白中的 6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析 ,经一步金属螯合亲和层析纯化后 ,重组蛋白在SDS PAGE上呈现出均一的单一条带 ,回收率达 6 8% .活性和纯度均较高的目的蛋白 3α HSD的获得 。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

睾丸酮丛毛单胞菌的分离和鉴定及3α-羟类固醇脱氢酶在大肠杆菌中的克隆表达

目的:从自然界中分离鉴定产 3α 羟类固醇脱氢酶(3α hydroxysteroiddehydrogenase, 3α HSD)的睾丸酮丛毛单胞菌,并在大肠杆菌(E.coli.)中克隆表达 3α HSD。方法:将池塘泥浆样品接种到以雄酮为唯一碳源的培养基中,对分离到的菌株根据形态学和生理生化特征进行初步鉴定。为进一步鉴定该菌株,根据睾丸酮丛毛单胞菌中的 3α HSD的基因设计引物,PCR扩增细菌基因组DNA,将扩增片段插入到载体pET15b中,构建重组质粒pET15b,并在E.coli. BL21 (DE3 )pLysS中进行诱导表达,对表达得到的蛋白进行鉴定并测定其酶活力。结果:一系列生化反应和培养特征证实,该菌与睾丸酮丛毛单胞菌的符合率为 85%,最适生长pH值为 7. 0,最佳生长温度为 30℃。在E.coli. BL21 (DE3 )pLysS中经诱导表达得到了相对分子质量约为 29×103具有酶活性的融合蛋白,可催化雄酮(3α 羟类固醇)脱氢。结论:从池塘泥浆中分离到一株产 3α HSD的睾丸酮丛毛单胞菌,并在E.coli.中表达得到了具有酶活性的融合 3α HSD。这为利用金属螯和亲和层析纯化融合 3α HSD,并进一步建立以其为工具酶的血清总胆汁酸酶循环测定方法奠定了基础。

葡萄糖3-脱氢酶工程菌的构建、表达及其合成3-酮对硝基苯井冈霉胺

采用基因挖掘技术,从NCBI数据库发现来源于Glaciecola polaris的葡萄糖3-脱氢酶基因,该基因经密码子优化后合成,构建p ET28b-GpG3DH重组表达载体,转入大肠杆菌E. coli BL21中进行重组表达,结果显示:GpG3DH实现了部分可溶表达,其分子量为5. 5×104。随后,优化了GpG3DH的表达条件,结果发现,重组菌在TB培养基中37℃培养至OD600为0. 8时,加入IPTG至终浓度为0. 5 mmol/L,16℃诱导表达10 h,GpG3DH酶活为2. 83×10-2U/m L。进一步将重组菌用于3-酮对硝基苯井冈霉胺的细胞转化法合成,细胞用10 mmol/L的EDTA处理,在p H为7. 5、25℃的条件下转化32 h,3-酮对硝基苯井冈霉胺的产率(Y3-KpNPV)为0. 54。

儿童对铅毒性易感性的性别差异与δ氨基-γ-酮戊酸脱氢酶基因型的关系研究

通过对298名6～10岁儿童δ氨基-γ=酮戊酸脱氢酶(ALAD)基因遗传多态性分析,探讨儿童对铅毒性易感性的性别差异与ALAD基因型的关系。方法:对在我院体检的298名6～10岁儿童进行两种ALAD等位基因(ALAD^1和ALAD^2)的频率测定并测定血铅浓度,分析两种ALAD等位基因和性别对铅毒性易感性的差异。结果:①所研究儿童ALAD^1-1型有257例,占86.2％;ALAD^1-2型有41例,占13.7％;②携有等位基因ALAD^1的儿童血铅水平几何均数为92μg/L;携有等位基因ALAD^2的儿童血铅水平几何均数为109μg/L。③男孩血铅水平几何均数为102μg/L;女孩几何均数为81μg/L。④男孩ALAD^1-1型有121例,占79.6％,ALAD^1-2型有31例,占20.4％,女孩ALAD^1-1型有136例,占93.2％,女孩ALAD^1-2型有10例占6.8％。结论:本组ALAD儿童基因存在遗传多态性;儿童ALAD基因型、性别与血铅显著相关,男孩携带等位基因ALAD^2的比率(20.4％)比女孩(6.8％)高可能是引起性别差异和重要原因之一。

分枝杆菌HGMS2中类固醇C20-羟基脱氢酶的鉴定

分枝杆菌常被用作甾体药物中间体生产菌种,然而当前人们对其具体的甾醇降解机制仍然不是很清楚。为了获得C20-羟基甾药中间体,文章直接以RS为底物进行了转化,并通过对转化产物进行TLC、HPLC、LS-MS和核磁分析,初步确定分枝杆菌中存在类固醇C20-羟基脱氢酶(1DHC)参与的代谢途径。同时,基于生物信息学和结构生物学,通过序列和结构比对分析,最终从分枝杆菌中鉴定出了一个与类固醇C20-羟基脱氢酶同源性很高的基因。将该基因在大肠杆菌中异源表达,并对其功能活性进行分析,证明该基因所编码的酶和类固醇C20-羟基脱氢酶具有相同的功能活性。文章首次从分枝杆菌中鉴定出一种类固醇C20-羟基脱氢酶,使研究者对分枝杆菌甾醇代谢机制有了更深入的理解,同时也为新型甾药中间体的制备以及分枝杆菌的改造奠定了理论基础。

钙浓度对聚谷氨酸合成通路中α-酮戊二酸脱氢酶的表达调控

本文研究了钙离子在纳豆芽孢杆菌HSF1410发酵聚谷氨酸过程中对α-酮戊二酸脱氢酶调控机制。实验发现,随着发酵液中添加钙离子浓度不断增大,ogdh基因转录水平也逐渐提高,进而提高酶表达量、增强酶活、提高聚谷氨酸产量。本实验为下一步从分子生物学角度研究聚谷氨酸合成途径与调节机制提供思路。

重组大肠杆菌表达17β-羟基类固醇脱氢酶全细胞催化合成宝丹酮的研究

宝丹酮作为一种重要的蛋白同化雄性激素类固醇,具有提升肌肉质量和耐力的功能。宝丹酮的传统合成方法是以1,4-雄烯二酮(ADD)为底物通过化学法合成,但过程复杂、污染严重。17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-HSD)可催化甾体化合物C-17位点的氧化还原反应,实现ADD和宝丹酮的相互转化。本研究通过基因序列同源性分析,筛选到6种不同来源的17β-HSD基因并对其在大肠杆菌中进行异源表达。利用不同重组菌转化ADD合成宝丹酮,结果表明重组菌BL21/pET28a-HSDPy的ADD转化率最高,因此选择BL21/pET28a-HSDPy进行进一步研究。鉴定了重组菌的酶学性质并优化其全细胞转化条件。结果表明在生物量为36 g·L^-1、底物浓度为5.40 g·L^-1条件下,经过两次补料,获得了3.66g·L^-1宝丹酮,比优化前提高了4.1倍。而且在生物转化过程中未检测到副产物。为生物合成宝丹酮提供了可能。

烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定

微生物转化在甾体药物合成中起着不可替代的作用,其中C1,2位脱氢是最为重要的反应类型。以烟曲霉(A.fumigatus)为出发菌株,运用同源序列比对从烟曲霉酸基因簇中钓取出kstDF序列。该基因与玫瑰色热微菌(Ther-momicrobium roseum)DSM 5159的kstD一致性为51%。构建pET28a(+)-kstDF表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(λDE3),获得高表达重组子菌株。经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析,发现高温(37℃)有利于KstDF蛋白表达,低温(20℃)有利于酶活的保持。该重组菌显示出良好的甾体转化能力,在12 h内完全转化13.3 mg.L-1雄甾-4-烯-3,17-二酮,为构建高效转化3-酮基-4-烯类固醇的基因工程菌奠定了基础。