α-银环蛇毒素基因的克隆及其非融合型原核表达

根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列推导出其DNA序列,设计并人工合成两两互补的14条寡核苷酸片段。经片段延伸、PCR、克隆,成功构建α-银环蛇毒素基因克隆质粒;质粒经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切回收后连接于表达载体pET28a(+)中,分别转化BL21(DE3)、BL21(DE3)Codon plus、BL21(DE3)plysS进行诱导表达,表达产物经Tris/tricine系统进行SDS-PAGE分析。结果表明:该基因已在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行了非融合表达,其表达量占细菌总蛋白的11.98%,主要以包涵体形式存在;同时对表达条件进行了优化,其表达量可达16.28%。经Western blot分析,在大约8 kDa处出现明显的目的带,与预计蛋白分子量大小一致,说明表达产物与天然α-银环蛇毒素具有相似的免疫原性。表达产物纯化、复性后经动物毒性试验表明:表达的α-银环蛇毒素蛋白具有生物学活性,小鼠腹腔注射其LD50约为1.28μg/g。

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化.采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品.首先从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品.然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性.ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g.结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的.

α-银环蛇毒素基因的克隆与表达

与传统的捕蛇或养蛇提毒的方法相比,利用基因工程方法生产蛇神经毒素具有明显的潜在优势。本研究结合国内外的研究现状,以α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)为例子来探讨蛇神经毒素基因在大肠杆菌表达体系中的表达情况及其规模生产的可行性。首先根据文献报道α-银环蛇毒素的氨基酸序列,推导出其DNA序列并设计成部分互补的4条寡核苷酸片段,利用DNA合成仪人工合成、纯化其寡核苷酸片段,通过片段退火、切口补平、连接、克隆、测序鉴定获得了α-银环蛇毒素基因;然后将α-银环蛇毒素基因克隆至pGEX-2T质粒中分别转化大肠杆菌DH5(和JM109进行表达分析,融合蛋白约占细菌总蛋白的30％～40％,其中部分为可溶性表达,部分以包含体的形式表达;对可溶性表达的条件进行了优化。最后以天然纯化的α-银环蛇毒素作为对照,分析融合方式表达的重组α-银环蛇毒素的活性,ELISA结果显示其与天然的α-银环蛇毒素比较具有相似的抗原性。

α-银环蛇毒素融合基因表达载体的构建及原核表达

设计并人工合成2条引物,对作者构建的重组质粒pMD-α-BGT进行PCR扩增获得α-BGT基因。将目的基因连接至pUCm-T载体构建克隆质粒pUCm-α-BGT。克隆质粒经BamHⅠ、NotⅠ双酶切后连接至融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,成功构建融合基因表达载体pGEX-α-BGT,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。表达产物经15%SDS-PAGE分析,在约34ku处可见明显的外源蛋白质表达带,与预计的分子量大小一致,其表达量约占细菌总蛋白的32.6%。Westernblotting和间接ELISA检测结果表明,α-BGT的融合表达蛋白与天然α-BGT标准品具有相似的抗原性。

β-银环蛇神经毒素结合蛋白的分离纯化

大鼠膈肌神经突触前膜上存在 β -银环蛇毒素结合蛋白。膈肌经匀浆、去垢剂抽提、离子交换层析、植物凝集素亲和层析及银环蛇毒素亲和层析 ,可获得纯化的 β -银环蛇毒素结合蛋白。其比结合活性达 1nmol/mg蛋白质。整个纯化过程的总得率为 3%。纯化蛋白制品的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示 ,有两个共纯化的多肽链 ,其分子量分别为 6 1和 6 9kD。

重组α-银环蛇毒素的纯化及活性分析

以表达重组α-银环蛇毒素的高效表达菌株BL21(PDZ04)为材料,研究重组α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin,α-BgTx)的分离纯化。采取亲和色谱和离子交换色谱的方法都得到了重组α-银环蛇毒素的纯品。参考文献报道的方法从天然的银环蛇毒干粉中分离纯化得到了天然α-银环蛇毒素的纯品。然后以天然α-银环蛇毒素为对照来检测重组α-银环蛇毒素的抗原性和毒性。ELISA结果显示其具有与天然α-银环蛇毒素相似的抗原性,以小鼠为动物模型,纯化的重组α-银环蛇毒素与天然α-银环蛇毒素相比,其腹腔注射的LD50也基本一致,约为0.22μg/g。结果表明利用基因工程的方法生产蛇神经毒素是可行的。

α-银环蛇毒素对中枢烟碱诱发小鼠惊厥效应的影响

１００μｇ／ｋｇα－银环蛇毒素（α－Ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ，α－ＢＧＴ）对大鼠脑室内注射烟碱５０μｇ／ｋｇ引起的惊厥反应的抑制率为４０％，ｄ－筒箭毒ＥＤ５０为１２．７μｇ／ｋｇ，六烃季胺ＥＤ５０为２２８．２μｇ／ｋｇ．在人工呼吸条件下，以烟碱引起的脑皮层电图去同步化为指标，１３０μｇ／ｋｇα－ＢＧＴ对烟碱效应的抑制率可达６０％，烟碱引起脑皮层电图低频区域的变化受到α－ＢＧＴ的明显影响．

功能化超顺磁性Fe3O4纳米微粒的制备及在β-银环蛇毒素检测中的应用

采用微波共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子并对其进行功能化修饰，探讨了制备功能化β—BGT磁性纳米微粒的最佳工作条件，建立了双抗体夹心磁分离酶免疫分析法检测β-BGT，结果表明，制备的功能化β—BGT磁性纳米微粒具有良好的活性，每mg磁微粒固定的生物素标记β—BGT多抗最大量为925μg。双抗体夹心磁分离酶免疫分析法检测β-BGT线性范围为0．062～125μg／L，线性回归方程为Y=0．705X＋1．017（R^2=0．991，n=12，P〈0．0001），检测限为O．062μg／L，具有较好的重现性。不同浓度的蓖麻毒素、相思子毒素、葡萄球菌肠毒素B对检测结果基本无干扰。

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX4T1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒αBgTX(P22A31)/pGEX4T1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30%,可溶形式存在的融合蛋白大于25%。

增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白及某些突触前毒素对其结合的抑制作用

β－银环蛇神经毒素阻遏神经肌肉接头递质释放的作用机理，可能与它结合于一种突触前的电压依赖的Ｋ~＋通道有关。本文报告了从大鼠膈肌膜组分中用去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ－１００增溶抽提β－银环蛇毒素结合蛋白的结果。这种结合蛋白抽提液的比结合活性为２００－４００ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，比膜制备物的比结合活力提高约一倍。抽提得率为５０％－７０％。抽提液与^（１２５）Ｉ标记的β－银环蛇毒素的结合可被曼巴蛇神经毒素（ｄｅｎｄｒｏｔｏｘｉｎ）完全抑制，其ＩＣ_（５０）约８×１０^（－８）ｍｏｌ／Ｌ。但另一种β型神经毒素，β－蝮蛇神经毒素（β－ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｔｏｋｉｎ）却完全不能抑制这种结合。这提示，β－蝮蛇毒素与β－银环蛇毒素具有不同的作用位点。

银环蛇蛇毒毛细管电泳分离与鉴定

采用自制的毛细管电泳装置在 2 4m in内分离并测定了湖南银环蛇蛇毒 ,证明银环蛇蛇毒中含有 α-银环蛇毒素(α-BTX)和 β-银环蛇毒素 (β-BTX) 。

尼古丁对人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-1、3表达的影响

目的:探讨尼古丁对体外培养人牙周膜细胞(hPDLCs)基质金属蛋白酶-1、3(MMP-1、3)表达的影响及可能机制。方法:采用原代组织块法培养hPDLCs,应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测尼古丁单独及联合应用α7亚型乙酰胆碱受体特异性拮抗剂α-银环蛇毒素(α-BTX)作用下,hPDLCs中MMP-1、3表达的变化。结果:尼古丁(10-4mol/L)作用于hPDLCs,其MMP-1、3mRNA及蛋白表达均有升高(P<0.05),此作用可被α-BTX(1.25×10-9mol/L)拮抗。结论:尼古丁可使体外培养的hPDLCs中MMP-1、3表达升高,此过程可能由α7nAChR通路介导。

电刺激迷走神经对脓毒症小鼠肠道通透性的作用及机制研究

目的探讨电刺激迷走神经对脓毒症小鼠肠道通透性的作用及机制。方法将50只C57BL/6小鼠随机分为对照组(CON组)、脓毒症组[脂多糖(LPS)组]、迷走神经切断组(VGX组)、电刺激迷走神经组(STM组)、α-银环蛇毒素(α-BGT)组,每组10只。LPS组、VGX组、STM组、α-BGT组均腹腔注射10 mg/kg LPS制备脓毒症模型,CON组则腹腔注射等体积生理盐水。CON组、LPS组仅暴露双侧颈迷走神经,VGX组、STM组、α-BGT组均切断双侧颈迷走神经,STM组电刺激左颈迷走神经,α-BGT组皮下注射α-BGT后再电刺激左颈迷走神经。处死各组小鼠后取回肠组织,光镜下进行组织病理学观察,评估肠道组织通透性,并检测紧密连接蛋白(ZO-1、claudin-2)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和核因子-κB(NF-κB)蛋白相对表达量。结果LPS组小鼠回肠组织肠黏膜上皮细胞损伤严重,微绒毛坏死、脱落,大量炎性细胞浸润,VGX组回肠组织病理学改变程度较LPS组加重,STM组回肠组织病理学改变程度较LPS组、VGX组减轻,α-BGT组肠黏膜上皮细胞损伤最严重。与CON组比较,LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织通透性均增加,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组、VGX组比较,STM组小鼠肠上皮组织通透性降低,差异有统计学意义(P<0.05);与STM组比较,α-BGT组小鼠肠上皮组织通透性增加,差异有统计学意义(P<0.05)。LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量高于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中ZO-1、claudin-2蛋白相对表达量低于STM组,差异均有统计意义(P<0.05)。LPS组、VGX组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于CON组,STM组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量低于LPS组、VGX组,α-BGT组小鼠肠上皮组织中MLCK、NF-κB蛋白相对表达量高于STM组,差异均有统计意义(P<0.05)。结论电刺激迷走神经有助于保护脓毒症小鼠的肠道屏障功能,其潜在机制或与激活胆碱能抗炎通路,进而抑制炎症反应相关。

蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的构建适合选择感染性噬菌体(Selectivelyinfectivephage,SIP)技术筛选的蛋白Ⅲ-α-银环蛇毒素(α-Bungarotox-ins,α-BTXs)融合蛋白表达质粒。方法从银环蛇毒腺中提取总RNA,RT-PCR扩增α-BTXs基因,插入表达载体pTTMIN,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western blot及竞争抑制ELISA法检测融合蛋白的表达。结果获得的α-BTXs基因序列与相关报道完全一致;融合蛋白表达质粒构建正确;融合蛋白的表达量可达菌体总蛋白的20%,可与抗蛇毒素血清发生特异性反应,且保持了α-BTXs的抗原性。结论成功构建了蛋白Ⅲ-α-BTXs融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白,为利用SIP技术筛选抗α-BTXs人源抗体奠定了基础。

β-银环蛇毒素结合蛋白抗体和乙酰胆碱受体抗体亲和性及其在重症肌无力致病中的意义

为了研究β-银环蛇毒素(β-BuTx )结合蛋白在重症肌无力(MG)致病中的作用和意义。我们用牛膈肌乙酰胆碱受体(AChR)和β-BuTx结合蛋白分别免疫Lewis鼠。结果显示AChR免疫鼠能诱导典型的实验性重症肌无力(EAMG)临床症状和血清中高效价的抗AChR抗体。β-BuTx结合蛋白免疫鼠组血清中虽然也能检测到较高效价的β-BuTx结合蛋白抗体,但未观察到明确的EAMG症状。分析和比较了两组免疫鼠血清抗体的亲和指数后发现,β-BuTx结合蛋白抗体亲和指数明显低于AChR抗体亲和指数。我们认为:β-BuTx结合蛋白在实验动物中具有抗原性,但它的抗体亲和性远较AChR为低,这可能是β-BuTx结合蛋白缺乏致Lewis鼠肌无力的重要因素之一。