毒蕈中α-鹅膏毒肽的中毒机制及检测技术研究进展

α-鹅膏毒肽是毒蕈中分布广、含量高且毒性极强的蘑菇毒素,其性质十分稳定,一般的加热烹饪方式难以使之失活,误食含有该毒肽的毒蕈可引发中毒效应,具体表现为呕吐、腹泻等严重胃肠道反应甚至可导致肝肾功能衰竭,其发病迅速且目前没有特效药可以解毒,对食品安全和人类的生命健康安全造成了极大的威胁。传统的检测方法存在设备不便携、成本昂贵、检测速度慢等弊端,因此,通过了解α-鹅膏毒肽的致毒机制和建立准确、高效、便捷的检测技术对于有效防范α-鹅膏毒肽中毒事件的发生意义重大。本文简要综述了α-鹅膏毒肽的中毒症状、中毒机制、现有的解毒方式,着重阐述了α-鹅膏毒肽的检测技术研究进展,并对未来快速免疫检测技术的发展进行了展望,以期为治疗α-鹅膏毒肽中毒和保障人类的生命健康安全提供有效的帮助。

正电性金纳米-核酸适配体纳米生物传感器快速检测野生菌中的α-鹅膏毒肽

目的 构建一种基于正电性金纳米-核酸适配体的纳米生物传感器,以实现野生菌中α-鹅膏毒肽(α-amanitin, α-AMA)的快速检测。方法 选择可与α-AMA特异性结合的核酸适配体作为识别元件,以半胱氨酸(cysteamine, Cys)修饰的正电性纳米金(gold nanoparticles, AuNPs)作为信号探针。基于静电吸附作用,将适配体固载到Cys@AuNPs表面。测定溶液在特定波长处吸光度值的变化,实现α-AMA的快速检测。结果 该纳米生物传感器检测α-AMA的最佳条件:Cys@AuNPs体积为150μL,适配体浓度为6 nmol/L, Cys@AuNPs与适配体反应时间为10min, α-AMA与适配体结合时间为10 min。在最佳条件下检测α-AMA的线性范围为1~125 ng/mL(r2=0.995)。本体系中α-AMA的检出限为0.87 ng/mL,加标回收率为98.6%~120.0%。结论 该纳米生物传感器操作简便、灵敏度高、特异性好、成本低廉,适用于野生菌样品中α-AMA的快速检测。

在线固相萃取-液相色谱-串联质谱法检测蘑菇中毒患者尿液中痕量α-鹅膏毒肽

建立了在线固相萃取-液相色谱-串联质谱(online SPE-LC-MS/MS)测定蘑菇中毒患者尿液中痕量α-鹅膏毒肽的分析方法。样品经甲酸酸化的乙腈-甲醇(5∶1,v/v)沉淀蛋白质,反相液液微萃取去除样品提取液中的有机溶剂,毒素经ODS微柱(5 mm×2.1 mm,5μm)在线SPE净化,XBridgeTM BEH C18色谱柱(150 mm×3.0 mm,2.5μm)分离,MS/MS测定。采用基于定量环的快速阀切换技术作为在线SPE和LC-MS/MS模块的接口,使得两个分离模块互相独立,无论是流动相还是压力,都不会互相干扰,保证了系统的稳定性;在线系统的精准净化,有效消除了后续质谱检测的基质效应,确保了尿液中痕量水平α-鹅膏毒肽的定性定量检测。尿液中α-鹅膏毒肽在0.1~50μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.9983;检出限(LOD)为0.03μg/L;α-鹅膏毒肽的加标(0.1、2.0和20μg/L)平均回收率为84.3%~91.7%,相对标准偏差(RSD)为3.8%~7.2%。体内鹅膏毒肽代谢迅速,生物基质中痕量水平毒素的检测是其中毒实验室鉴定的主要难题,通过实际样品检测,证明该法操作简单,准确、灵敏;溶剂沉淀蛋白质和反相液液微萃取去除有机相和脂溶性基质的简单操作,可以作为水溶性毒素在线SPE-LC-MS/MS检测时快速且有效的配套前处理方法;基于在线SPE精准净化技术,可以实现尿液中α-鹅膏毒肽的高灵敏度测定(LOD为0.03μg/L),解决了中毒时患者体内痕量水平α-鹅膏毒肽定性确证的难题,部分患者α-鹅膏毒肽中毒实验室鉴定的时间可以扩展到90 h以上;同时,痕量水平的定量检测技术,可以为中毒后迅速代谢的α-鹅膏毒肽在体内的剂量反应关系研究提供可靠的技术支撑。

反相高效液相色谱法分离纯化α-鹅膏毒肽

用反相高效液相色谱法,以0.02 mol/L醋酸铵-乙腈为流动相的梯度洗脱模式,从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出α-鹅膏毒肽,产量可达到每克蘑菇干子实体6556μg。产品纯度达99％以上,回收率为96％。给出了α-鹅膏毒肽定量分析的线性回归方程S=6634032C-54620。

灵孢多糖对α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝肾的保护作用

目的:研究灵孢多糖对α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝肾的影响并探索其对α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝肾的影响是否存在量效关系。方法:将昆明雄性小鼠48只随机分为六组,即空白组、毒模组、灵孢多糖治疗1～4组,每组8只,复制α-鹅膏毒肽中毒模型4h后,空白组、毒模组腹腔注射生理盐水0.5mL,4个治疗组分别腹腔注射灵孢多糖0.5、1.0、2.0、4.0mL/kg,每天1次,连续3d。观察动物的行为表现及生存状况,实验72h小鼠摘眼球取血后对其进行解剖,计算肝肾脏器系数;检测ALT、AST、BUN、SCR;光镜下观察肝肾的病理组织改变。结果:与毒模组比较,灵孢多糖治疗组小鼠行为表现较好,肝肾脏器系数降低(P<0.05),ALT、AST、BUN、SCR较毒模组下降明显(P<0.05),肝肾病理损害程度减轻。结论:灵孢多糖对α-鹅膏毒肽中毒小鼠的肝肾具有保护作用,在本实验中灵孢多糖对α-鹅膏毒肽中毒小鼠的肝肾保护存在量效关系。

α-鹅膏毒肽的研究和哲学思考

α 鹅膏毒肽是存在于鹅膏菌属真菌中的一种毒素 ,常常引起人和动物的中毒与死亡。长期以来 ,肝细胞坏死被认为是α 鹅膏毒肽作用的主要机制 ,但新近的一些研究提示 :该毒素尚可能具有引起小鼠肝细胞凋亡的潜在作用。这种作用如果存在 ,意味着其有可能被用于肝脏肿瘤的治疗。毒素是一种有害物 ,而药物则是具有应用价值的物质。从哲学的观点来看 ,任何事物都具有正反两方面的作用 。

α-鹅膏毒肽诱导肝细胞毒性作用机制的研究进展

鹅膏菌是一类可引起急性中毒的蘑菇种属,90%以上野生菌中毒死亡事件均由鹅膏毒肽引发,α-鹅膏毒肽(α-amanitin、α-AMA)是其中毒性最强的成分,肝脏是其毒性靶器官。RNA聚合酶Ⅱ(RNA polⅡ)转录抑制是α-鹅膏毒肽导致肝细胞损伤的公认机制,但其他可能的毒理学机制尚待阐明。主要从α-鹅膏毒肽诱导肝细胞凋亡、自噬、炎症、氧化应激等毒性机制,中毒后临床治疗等方面进行综述,旨在为鹅膏毒肽中毒研究以及防治提供新的思路。

ROS激活P53调控线粒体凋亡途径在α-鹅膏毒肽中毒肝损害中作用的研究进展

α-鹅膏毒肽(α-AMA)是含鹅膏毒肽类毒蘑菇最常见的毒素种类,现已成为我国食物中毒最主要致死因素,但α-AMA中毒肝损害的具体机制尚未清楚,且无特异性解毒剂,因此成为人们关注的焦点。α-AMA中毒导致氧化还原平衡失调产生过多活性氧(ROS)是肝损害重要因素之一,ROS作为凋亡上游信号分子激活P53表达,向线粒体内易位促进细胞色素C释放,抑制B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族基因和促进Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因表达,进而使含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)级联反应触发线粒体凋亡途径,最终导致肝细胞异常凋亡造成肝脏严重损害。作者就ROS激活P53调控线粒体凋亡途径与α-AMA中毒肝损害之间的关系作一综述,进一步阐述α-AMA中毒肝损害的机制,展望α-AMA中毒肝损害治疗新方向。

采用Box-Benhnken响应面法优化致命鹅膏α-鹅膏毒肽超声波提取工艺

通过单因素实验考察提取次数、超声波处理时间、甲醇体积浓度、超声波功率和料液比对致命鹅膏(Amanita exitialis)α-鹅膏毒肽提取得率的影响,获得关键因素及其最佳条件,再采用Box-Benhnken响应面法优化α-鹅膏毒肽超声波提取工艺。研究结果表明:致命鹅膏α-鹅膏毒肽最佳提取工艺为提取2次、超声波处理15 min、甲醇体积浓度35%、超声波功率300 W、料液比1∶20(g∶mL),α-鹅膏毒肽提取得率为3.33 mg·g^(-1)干重,与预测值3.30 mg·g^(-1)干重无显著差异(P>0.05),说明获得的最佳提取工艺稳定、可行。

亲水液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法同时测定野生蘑菇中α-鹅膏毒肽与2种精神紊乱型毒素

文章建立了亲水液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法同时测定野生蘑菇中α-鹅膏毒肽与2种精神紊乱型毒素的分析方法。样品经去离子水提取、低温高速离心后,用1%甲酸-乙腈稀释,上清液过膜后用ACQUITY BEH Amide柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm)分离,全信息串联质谱正离子模式检测。在1~100 ng/mL的线性范围内,3种毒素的相关系数为0.9969~0.9998,检出限在5~25 mg/kg之间,定量限在15~75 mg/kg之间;在3个加标水平下平均回收率为70.3%~104.1%,相对标准偏差为0.1%~4.4%(n=6)。该方法快速准确,适合于野生蘑菇中3种不同类型毒素的同时分析检测。

超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱指纹图谱检测毒蕈中4种鹅膏肽类毒素

建立了基于超高效液相色谱-电喷雾离子化-四级杆飞行时间串联质谱技术(UPLC-ESI-Q-TOF)的4种鹅膏肽类毒素特征信息的色谱和质谱指纹图谱和分析鉴定方法。样品用含0.1%TFA的甲醇溶液提取后,再用Oasis HLB固相柱净化,洗脱液经UPLC HSS T3色谱柱分离后,采用ESI-TOF MS和ESI-Q-TOF MS2进行测定;建立了包含毒素准分子离子准确质量数及其同位素特征,以及二级质谱特征子离子信息的指纹图谱;方法定量测定的线性范围在50～1000μg/L,相关系数在0.9974～0.9985之间;4种毒素的检出限均为10μg/L;定量限为50μg/L;加标回收率在68.2%～88.2%之间;相对标准偏差为7.2%～11.8%。对采集的20余种野生菌样品进行分析,有5种样品检测出含有毒素。本方法快速、准确、选择性好、特异性强,适用于突发毒蕈中毒事件样品中α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽的确证分析。

水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的保护作用

目的:建立α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤模型并评价水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的治疗作用。方法:取健康昆明种小鼠60只,随机分为6组,每组10只,各组分别按0.10,0.20,0.35,0.70,1.32,2.50μg·g-1ipα-鹅膏毒肽,观察7d,用改良寇氏法计算α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的LD50和LD90;取健康昆明种小鼠120只,分为0,12,24,36,48,60,72h组,共6组,采用LD50α-鹅膏毒肽建立小鼠急性肝损伤的时效关系模型;分别取健康昆明种小鼠120只,各分为6组,每组20只,分别为空白组,模型组,水飞蓟宾预防性或治疗性给药组,采用LD90α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤模型,死亡率考察水飞蓟宾对肝损伤小鼠的预防与治疗作用,预防组的水飞蓟宾的剂量分别为10,25,50,100μg·g-1,治疗组的水飞蓟宾的剂量为100μg·g-1,但分为不同的时间组,即10,20,40,60min水飞蓟宾给药组,均尾静脉注射给药,观察7d,并记录小鼠的死亡情况;另取健康昆明种小鼠36只,分为3组,每组12只,分别为空白组、模型组,水飞蓟宾组(100μg·g-1),观察肝组织中天门冬氨酸氨基转移酶(AST),谷氨酸转氨酶(ALT),丙二醛(MDA)的水平及超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并观察肝组织的病理形态的变化。结果:α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤LD50和LD90分别是0.36μg·g-1和0.50μg·g-1;ipLD90α-鹅膏毒肽前60min,尾静脉注射25μg·g-1的水飞蓟宾就能保护全部动物,在ipLD90α-鹅膏毒肽10min后,尾静脉注射100μg·g-1的水飞蓟宾几乎保护全部动物,显著降低了死亡率,在40min后给予水飞蓟宾这种保护作用减弱;与空白组比较,模型组的AST,ALT,MDA的水平明显升高,SOD的活性明显降低(P<0.01),与模型组比较,100μg·g-1水飞蓟宾能够显著降低LD50α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝损伤的AST,ALT,MDA水平及升高SOD活性,病理图片观察模型组肝小叶结构不清,肝细胞索排列紊乱,肝细胞水肿,部分有空泡样改变,点状坏死,水飞蓟宾组肝组织明显改善。结论:水飞蓟宾对α-鹅膏毒肽所致小鼠急性肝的损伤有一定的保护作用。

a-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的制备和鉴定(英文)

-鹅膏毒(环)肽和二羟鬼笔毒(环)肽是剧毒的鹅膏菌和其它几种致死毒菌中由一些修饰氨基酸组成的环肽毒素。由于-鹅膏毒肽对真核生物的mRNA合成的专一性抑制和和二羟鬼笔毒肽对肌动蛋白的专一性束缚,因而它们在分子生物学和细胞学研究中具有重要应用,对其需求逐步增加。为此,作者使用了一种改良的毒素提取方法,以制备高效液相色谱从灰花纹鹅膏菌中分离制备-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,并通过紫外吸收光谱和质谱进行鉴定,表明-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离效果好,纯度高。本方法对其它毒菌中的-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽的分离制备具有同样的应用价值。

α-鹅膏[蕈]毒环肽核酸适配体的筛选和结构分析

α-鹅膏[蕈]毒环肽(α-amanitin)是从致命鹅膏毒伞子实体中分离的多肽物质。本文采用配体指数富集系统进化(systemic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术,以α-鹅膏[蕈]毒环肽为靶蛋白,以亲和填料epoxy-activated sepharose 6B为筛选介质,从体外合成的随机单链DNA文库中筛选其核酸适配体。经过12轮筛选,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的12条核酸适配体进行分析。二级结构预测分析表明,茎环和口袋结构为主要的结构形式,提示其可能是核酸适配体与α-鹅膏[蕈]毒环肽特异性结合的基础。对得到的核酸适配体进行特异性和灵敏度检测,其中E06核酸适配体的特异性最好,为核酸适配体检测蘑菇中α-鹅膏[蕈]毒环肽的残留奠定了基础。

7种鹅膏菌属真菌肽类毒素的HPLC分析(英文)

利用HPLC法对长白山地区分布的7种鹅膏属真菌成熟子实体中的α鹅膏毒肽(αamanitin)、β鹅膏毒肽(βamanitin)和鬼笔毒肽(phalloidin)的含量进行了测定。结果表明:芥橙黄鹅膏(Amanitasubjunquillea)和橙黄鹅膏(Amanitaaff.citrina)中均含有3种毒素,其中芥橙黄鹅膏的α鹅膏毒肽含量为2395.91μg/g、β鹅膏毒肽含量为1653.75μg/g和鬼笔毒肽含量为405.26μg/g;橙黄鹅膏的分别为1121μg/g、4244μg/g和9442μg/g。芥橙黄鹅膏白色变种(Amanitasubjunquilleavar.abla)中含有β鹅膏毒肽,其含量为614.00μg/g。其他5种鹅膏中均未检测到上述3种毒素。

鳞柄白毒鹅膏菌中α-amanitin的分离与鉴定

利用反相高效液相色谱和紫外吸收光谱技术,以乙腈-0.02mol/L醋酸铵为流动相的梯度洗脱模式,对采集自四川省阿坝州三江自然保护区的鳞柄白毒鹅膏菌子实体中α-鹅膏毒肽含量的分布情况进行研究.研究发现,α-鹅膏毒肽水溶液稳定性很好,其定量分析的线性回归方程为Y=5159x+1097.4,鳞柄白毒鹅膏菌子实体中α-鹅膏毒肽的含量为2838.8μg/g干子实体.α-鹅膏毒肽在子实体中的分布具有组织特异性,在菌裙中含量最高,约占α-鹅膏毒肽总量的51.09%,且在单位组分中,α-鹅膏毒肽的量也最高约至菌裙组干重的0.29%.

鹅膏菌中毒导致急性肝损伤的机制及治疗研究进展

鹅膏菌在全世界分布广泛,大部分为剧毒菌种,且蘑菇中毒事件多由鹅膏菌剧毒菌种引起。鹅膏菌中毒主要由鹅膏肽类毒素导致,所含的α-鹅膏毒肽是其中最重要的一种,为双环八肽结构,化学性质稳定,可致严重肝损伤。由于缺乏特效解毒药物,临床上在诊治鹅膏菌中毒方面面临很多困难,因此鹅膏菌中毒患者预后较差。α-鹅膏毒肽导致严重肝损伤的机制主要是特异性抑制RNA聚合酶Ⅱ,并导致线粒体功能障碍、细胞凋亡、氧化应激等。根据中毒特点,近年来在治疗鹅膏菌中毒方面有了一定的突破。本文就鹅膏菌中毒导致急性肝损伤的机制及治疗进展进行综述。

大鼠血清和尿液中4种鹅膏肽类毒素代谢特征的超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱分析

目的建立血清和尿液中4种鹅膏肽类毒素的超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱测定方法,考察和分析4种鹅膏肽类毒素在大鼠体内的代谢特征,为中毒样品的采集提供科学依据。方法血清样品用乙腈+0.1%TFA二氯甲烷提取,残渣用流动相溶解;尿液样品则直接过0.22μm微孔滤膜;样品溶液经HSS T3色谱柱分离后用ESI-QTOF MS进行测定;选取SD健康大白鼠分别用4种鹅膏肽类毒素染毒,按需收集不同时间段的尿液和血液进行分析。结果血清和尿液样品的检出限分别为10 ng/ml和5 ng/ml,加标回收率分别为77.4%~95.6%和73.8%~103.8%,相对标准偏差在3.0%~18.0%和1.2%~25.4%。大鼠染毒尿液中均检出4种毒素,鹅膏毒肽的含量明显比鬼笔毒肽的含量高,大鼠染毒血清中仅14%检测到毒素的存在。结论检测方法适用于中毒事件生物样品中4种鹅膏肽类毒素的检测和确证分析,采集中毒8 h内的尿液对检出鹅膏毒肽的几率最大。

血浆置换在急性白毒伞中毒性脑病治疗中的作用

目的探讨急性白毒伞中毒性脑病应用血浆置换的治疗机制。方法收集急性白毒伞中毒性脑病患者40例,随机将其分为血浆置换组及传统血液净化组,每组各20例。传统血液净化组患者采用传统血液灌流联合血液透析或血液滤过,血浆置换组行血浆置换,必要时联合血液滤过治疗。检测2组患者治疗前后血液、脑脊液中α-鹅膏毒肽的浓度,同期进行肝、肾功能等生化指标检测。结果经治疗后,血浆置换组患者血液、脑脊液中α-鹅膏毒肽浓度均显著下降(P均<0.01);传统血液净化组对α-鹅膏毒肽清除效果较差,治疗前后无明显差异(P>0.05)。2组患者治疗前后生化指标均有明显改善(P均<0.01);与传统血液净化组比较,血浆置换组患者肝功能改善更加明显(P<0.01)。结论血浆置换能有效清除血液中α-鹅膏毒肽,降低脑脊液中α-鹅膏毒肽浓度,减轻其对神经系统的损害,同时兼有人工肝脏替代治疗的作用,是急性白毒伞中毒的首选治疗措施。

血浆置换治疗急性白毒伞中毒65例临床分析

目的总结急性白毒伞中毒患者的临床表现,并观察应用血浆置换治疗的临床效果。方法回顾性分析65例急性白毒伞中毒患者的临床表现,比较传统血液净化与血浆置换治疗前后患者的血液和脑脊液中的α-鹅膏毒肽的浓度变化。结果患者在食用食蕈后6~12h出现系列临床症状,大部分出现胃肠炎症状,53例重症。所有患者均出现谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）活性增强,直接和间接胆红素增高。血浆置换组患者脑脊液和血液中α-鹅膏毒肽浓度下降明显高于传统血液净化组（P〈0.01）,且血浆置换组第二疗程治疗效果好于第一疗程（P〈0.01）。结论以血浆置换为主的综合血液净化治疗可有效降低急性白毒伞中毒患者的毒肽水平,提高抢救成功率,改善患者预后。