蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体的构建

目的构建蓝氏贾第鞭毛虫alpha-8贾第素(α-8 giardin)特异性锤头状核酶-GCV重组载体。方法采用RNA draw软件对蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素基因序列(GenBank登录号为AY781323)的二级结构进行模拟分析,按照G∶C比例和锤头状核酶设计原则,选取合适的核酶切割靶点,设计特异性锤头状核酶(H8)序列,并将其与犬贾第虫病毒(GCV)连接,获得α-8贾第素特异性锤头状核酶-GCV重组载体(pGCV634/H8/1423)。将载体线性化体外转录产物电击转染至贾第虫滋养体细胞内。提取转染后24 h的各组虫体总RNA,并以其为模板采用RT-PCR验证转染效果及对靶mRNA的切割效果。结果成功设计、合成了蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素mRNA锤头状核酶序列(H8),将其与犬贾第虫病毒载体(GCV)连接,成功构建了pGCV634/H8/1423;RT-PCR实验结果表明,重组载体pGCV634/H8/1423转染贾第虫细胞后24 h可检测到核酶RNA的存在,并实现了对α-8贾第素mRNA高效、特异的切割作用。结论构建的pGCV634/H8/1423能有效转染至贾第虫细胞内,并在其细胞内对α-8贾第素基因的mRNA具有高效、特异的切割作用。

蓝氏贾第鞭毛虫α-8贾第素特异性优势抗原表位肽的抗原性分析

目的 筛选蓝氏贾第鞭毛虫（简称贾第虫，Giardia lamblia）α-8贾第素（α-8 giardin）的优势抗原表位肽，并分析其抗原性。 方法 采用DNAstar、Biosun软件及CLUSTAL W软件进行生物信息学分析，筛选出贾第虫α-8 giardin的3个优势抗原表位肽，即G1（7～17 aa）、G2（30～40 aa）和 G3（296～306 aa）；3个抗原表位肽分别与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联后（KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3）免疫雌性青紫蓝家兔（每组2只），分别行背部皮下多点（8～10点）免疫注射，首次免疫各偶联蛋白0.5 mg/只（每点100 μl）。分别于首次免疫后14、21、28 d进行加强免疫（各偶联蛋白0.2 mg/只），于每次免疫前进行兔耳缘静脉采血，末次加强免疫后7 d颈动脉取血（各50 ml）。用间接ELISA检测3种（KLH-G1、KLH-G2和KLH-G3）免疫抗血清中IgG抗体效价；蛋白质印迹（Western blotting）分析3种免疫抗血清与重组蛋白rGiardin的抗原性。 结果 利用生物信息学相关软件筛选出的贾第虫α-8 giardin 3个候选抗原表位肽分别与KLH偶联后获得3个偶联蛋白（KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3），经纯化后蛋白浓度分别为0.66、0.95和0.25 mg/ml。分别于加强免疫家兔后7 d，ELISA检测结果显示，3种（KLH-G1、KLH-G2、KLH-G3）免疫抗血清的抗体效价分别为1∶12800，1∶51200，1∶51200；SDS-PAGE分析结果显示，经纯化后的3种抗血清均在相对分子质量（Mr）约36 000处出现特异性的清晰条带，无其它杂带。Western blotting分析结果显示，3种抗血清均可特异性识别重组蛋白rGiardin。 结论 筛选出的贾第虫α-8 giardin 3个优势抗原表位肽与KLH偶联后免疫家兔，可诱导产生特异性IgG抗体；3种免疫抗血清中的特异性IgG抗体均可识别重组蛋白rGiardin；3个贾第虫α-8 giardin抗原表位肽均有较好的抗原性。