超高压对α-CGTase产物专一性的影响

探讨了不同压力、不同温度对于α-CGTase产物专一性的影响,以及高压处理过后反应不同时间产物专一性的变化,确定了超高压作用于α-CGTase后环化反应产物专一性的变化规律。结果表明:在40℃,200 MPa下超高压不仅可显著提高α-CGTase产物专一性,同时保持较高酶活与产物得率。在40℃条件下,不同压力处理α-CGTase,随着压力升高,α-CGTase环化活力逐渐降低,反应产物专一性不断提高;在200 MPa下,不同温度处理α-CGTase,酶环化活力随温度升高而降低,产物专一性随温度升高先升高后降低;此外,高压处理α-CGTase后产物专一性随着反应时间的延长而降低。

紫外线和亚硝酸诱变选育高产α-环糊精葡萄糖基转移酶菌株

通过单因素实验,对已筛选出的产酶菌株N1进行诱变处理,结合甲基橙平板筛选和α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)活力测定,确定了紫外线和亚硝酸的诱变剂量,获得了一株α-CGTase活力较高的菌株B3。实验结果如下:距离20 W紫外灯30 cm,照射100 s,0.25 mol/L的HNO2处理30 min,效果较好。出发菌株N1酶活为0.62 U/mL,经过诱变获得高产菌株B3酶活力是3.76 U/mL,发酵生产的α-CGTase活力比原始菌株提高了506%。经8代稳定性实验,B3的活力稳定在3.760±0.030 U/mL。

响应面法优化多黏芽孢杆菌产α-环糊精葡萄糖基转移酶发酵培养基

为了提高多黏芽孢杆菌YLW-8产α-环糊精葡萄糖基转移酶的能力,对培养基条件进行优化,并利用优化后的培养基条件考察培养时间及不同初始p H对YLW-8产酶的影响。采用Plackett-Burman重要因素筛选实验筛选出影响产酶的3个主要因素:玉米淀粉、麸皮、磷酸氢二钾。在此基础上利用最陡爬坡实验逼近最大响应值区域,最后利用中心组合实验确定主要因子之间的交互作用及最佳条件。结果表明,玉米淀粉1%,硫酸铵0.15%,麸皮1.5%,碳酸钙0.5%,蛋白胨0.5%,磷酸氢二钾0.01%,酵母膏0.4%,硫酸镁0.015%时,α-环糊精葡萄糖基转移酶的酶活为3089.8U/m L,利用该培养基条件培养时间可缩短至3d,初始p H8.0。该条件可以降低染菌的几率,大大减少生产成本,可应用于α-环糊精生产工业。

磁性壳聚糖微球固定化环糊精糖基转移酶催化合成α-熊果苷的研究

利用磁性壳聚糖微球固定化环糊精糖基转移酶合成α-熊果苷,采用透射电镜、扫描电镜及傅里叶红外光谱对凝胶颗粒及固定化载体进行表征,探讨了固定化条件及固定化酶的相关酶学性质。结果表明,环糊精糖基转移酶固定化最优条件为:戊二醛体积分数为2%,交联时间为4 h,加酶量为0.45 mg/m L,固定化时间为5 h。相比游离酶,固定化酶温度稳定性提高,重复催化反应5次后,仍能保持初始转化率的46.3%。

α-环糊精葡萄糖基转移酶的高效表达及酶法制备AA-2G条件优化

目的构建分泌表达α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-Cyclodextrin Glycosyltransferase,α-CGTase)的重组菌株,并利用该酶液制备AA-2G。方法经PCR扩增浸麻芽孢杆菌154基因组获得α-CGTase基因序列,将该基因序列和p ET26b载体分别经Nco I、Xho I双酶切后用T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌BL21。利用发酵培养基分泌表达α-CGTase,利用该酶和淀粉糊精、维生素C反应制备AA-2G,并进行制备条件优化。结果在大肠杆菌中实现了α-CGTase的胞外分泌表达,胞外环化酶活力达到120 U/m L,利用该酶的转糖基反应将淀粉糊精、维生素C转化为AA-2G,经HPLC检测正确。结论利用自制α-CGTase得到了AA-2G,通过制备条件优化AA-2G产量为17.46 g/L,转化率达到58.2%(mg/mg)。

酶法改性甜菊糖甙的工艺研究

本研究旨在通过α-淀粉酶和环糊精转糖苷酶(CGTase)对甜菊糖甙分子进行改性研究,以期改善甜菊糖甙的后苦味,经优化并最终获得酶法改性甜菊糖甙的生产工艺条件。本工艺的主要流程为:淀粉水解→酶法改性→脱色→树脂纯化→喷雾干燥,其中酶法改性为工艺中的关键步骤。本实验还研究了上述反应中淀粉溶液的浓度、温度、pH、时间、酶的用量及淀粉与甜菊糖甙的物料比对反应的影响。

酶法提高罗汉果提取物中甜苷V含量的工艺研究

以罗汉果干果为原料,采用超声波辅助提取得到罗汉果甜苷物提取液,加入α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase),在单因素试验基础上进行正交试验研究罗汉果提取物中苷类物质转化为苷V的工艺条件。结果表明,转化的最佳工艺条件为:pH5.5,酶与葡萄糖反应温度45℃、反应时间10 min、酶与提取液的比1∶1、料液比1∶14g/mL。经测定,得到的反应产物中苷V的质量浓度为0.051 mg/100 mL,比初始提高约2.25倍。

来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶在毕赤酵母和枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-CGT酶基因,将基因片段分别克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K和大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pMA5中,分别转化毕赤酵母KM71和枯草杆菌WB600。结果表明,重组毕赤酵母发酵上清液中α-CGT酶活性仅0.2U/mL,重组枯草杆菌产酶达到1.9U/mL。对重组枯草杆菌发酵条件进行了优化,当以TB为出发培养基,初始pH6.5,温度为37oC时,摇瓶培养24h后α-CGT酶环化活性达到4.5U/mL(水解活性为3200IU/mL),是野生菌株软化芽孢杆菌表达量的9.8倍。

麦芽糖诱导软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草杆菌中的表达

通过PCR扩增软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶基因,将基因片段克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103中,转化枯草杆菌WB600得基因工程菌进行外源表达。在1.5%的麦芽糖初始发酵培养基上摇瓶培养,48 h后重组枯草杆菌产酶活性为6.1U/ml。通过单因素分析和响应面分析对重组枯草杆菌产CGT酶摇瓶发酵条件进行优化。分析得到培养基关键组分麦芽糖,玉米淀粉和酵母粉三者最佳浓度分别为:15.5g/L,13g/L和20g/L。在此条件下,摇瓶培养36h后α-CGT酶活性为17.6U/m l,5L罐分批发酵30h后酶活达到20U/ml(水解活性为1.4×104IU/ml)。