微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究进展

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Alpha-L-arabinofuranosidase,α-L-AFase)属于糖苷水解酶类,主要功能是水解阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖取代基,并与其他水解酶协同促进半纤维素的降解,从而改善半纤维素的生物转化率。本文综述了近年来微生物来源α-L-AFase的酶学特性、性质改良、结构、催化机制和协同作用效应等方面的研究进展,发现不同微生物来源的α-L-AFase的理化性质、分子结构和催化机制均存在着多样性,重组表达的方法能有效改善α-L-AFase的活性和稳定性,且α-L-AFase与其他半纤维素水解酶的协同催化作用使底物的转化效率显著提高。α-L-AFase广泛应用于改善面团发酵质地、果汁澄清、酿酒工艺优化、制备高消化率饲料以及功能性保健产品研制等多个领域。本文为后续α-L-AFase的基础研究、开发和利用提供一定的参考。

Bacillus tropicus来源β-D-呋喃果糖苷酶基因的克隆与表达及其酶学特性研究

为获得新β-D-呋喃果糖苷酶资源并探究其酶学性质及在转化糖中的应用潜力,挖掘出Bacillus tropicus来源的β-D-呋喃果糖苷酶基因BtFFase8,成功合成后表达在大肠杆菌宿主中。通过数据库筛选β-D-呋喃果糖苷酶的基因序列,将基因克隆至载体pET-28a(+)中。将获得的重组质粒转化至大肠杆菌BL21,构建重组菌株大肠杆菌BL21/pET28a-BtFFase8。采用亲和层析纯化克隆酶,用SDS-PAGE法分析蛋白分子量,通过葡萄糖试剂盒检测酶水解产物的能力得到酶活力,用福林酚试剂法测定蛋白质含量。克隆酶BtFFase8的分子质量为57.0 kDa,对蔗糖底物的比酶活力为13.4 U/mg;BtFFase8的最适pH和最适温度分别为pH 6.5和45℃,且在pH 5.0~8.0和40℃及以下温度保持酶活力稳定,残余酶活力大于80%;BtFFase8能耐受碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和胰蛋白酶的水解,残余酶活力大于70%。BtFFase8的发现及克隆酶优良的酶学功能为其未来应用于食品加工,特别是在转化糖的生产中奠定了良好的理论基础。

蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用

通过鉴定筛选得到1株高产β-葡萄糖苷酶的长白山虫草属真菌蛹虫草。研究碳源、氮源及pH值对菌株产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸与生物量的影响规律,从而获得高产生物活性物质的培养条件,并对蛹虫草转化人参皂苷Rg1与Rc的路径与转化率进行了研究。采用紫外检测法测定β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力,超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法鉴定转化产物中人参皂苷的组成,利用高效液相色谱法测定虫草素含量及人参皂苷的转化率。结果表明:蛹虫草在碳源为纤维二糖、氮源为牛肉膏、pH 8、培养120 h条件下有较高β-葡萄糖苷酶活力((74.70±0.09)U/mL)。在碳源为乳糖、氮源为蛋白胨、pH 4、培养72 h条件下有最高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力((11.55±0.01)U/mL)。蛹虫草转化人参皂苷Rg1的路径为Rg1→Rh1和Rg1→F1,转化Rc路径为Rc→Rd→Rg3→CK和Rc→CMc。经过168 h的转化,人参皂苷Rg1转化率为54.9%,Rc转化率达到83.44%。本研究为提高药食两用真菌蛹虫草生物转化人参皂苷效率提供了理论基础,也为蛹虫草和人参食品、药品开发提供了一定理论支持。

桃果实成熟软化过程中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性和乙烯合成相关因子的变化

以‘雨花三号’水蜜桃果实为试材,采用气相色谱法测定了桃果实成熟过程中乙烯释放量、氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶活性和ACC含量的变化,同时分析了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Afa)活性的变化。探讨了乙烯合成的相关因子和α-Afa对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,乙烯释放量、ACC氧化酶活性和ACC含量同时于成熟度Ⅳ出现高峰,α-Afa活性在成熟前期变化平缓,而在成熟中后期明显上升。本实验初步探明了α-Afa与乙烯的相互作用关系及其对桃果实成熟后期快速软化的作用机理。

阿拉伯呋喃糖苷水解酶对啤酒大麦麦芽过滤性能的影响

阿拉伯呋喃糖苷水解酶(Arabinoxylan arabinofuranohydrolase,AXAH)是阿拉伯木聚糖完全降解的关键酶之一。本文比较了过滤性能差异显著的江苏单二和港啤大麦麦芽与进口Metcalfe和Baudin大麦麦芽中的AXAH活力,发现单二和港啤中的AXAH平均活力只是Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。为了进一步确定AXAH对大麦麦芽过滤性能的影响,文章通过硫酸铵分级沉淀、SP FF和Q FF离子柱层析以及Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析技术对单二大麦麦芽中AXAH进行了纯化,并将其添加到协定糖化过程的起始阶段。结果发现,当加酶量达到6mU/g时,协定糖化麦汁的过滤速度提高了34.2%,粘度降低了5.5%,麦汁浊度增加了32.5%。这一结果表明,添加AXAH及其与其他水解酶协同作用,促进了多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖以及高分子氮的降低,也促进了阿拉伯木聚糖和麦汁总氮含量的升高。

香蕉果实成熟软化时果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的变化(英文)

阿拉伯糖是果实软化过程中变化最明显的细胞壁糖残基之一,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是导致细胞壁多糖中阿拉伯糖残基降解的主要糖苷酶。为阐明该酶在香蕉果实成熟软化中的作用,实验对香蕉贮藏过程中果皮和果肉中该酶活性以及果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量的变化进行了研究。结果表明:α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果实初期的变化很小,到果实硬度开始急剧下降时达到最大,增加量达10倍以上,且果肉中的酶活性大于果皮中;乙烯吸收剂处理延缓了香蕉果实呼吸和乙烯高峰的出现时间,降低了果实硬度、果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性变化的速度和幅度。以上结果表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起诱导香蕉果实成熟的作用,在果实的软化中起着十分重要的作用,且其活性受乙烯的调节。

7-羟基香豆素基α-L-阿拉伯呋喃糖苷的合成

以L-阿拉伯糖为原料,经3步反应得到全乙酰化阿拉伯糖。随后,以全乙酰化阿拉伯糖为原料,合成了各种糖基供体。最后将这些糖基供体和7-羟基香豆素进行糖苷化反应条件优化,经过一系列的条件筛选,最后发现,以全乙酰化-L-阿拉伯糖为糖基供体、120 mol%的Sn Cl4为活化剂、乙腈为溶剂,在-10℃下加入反应,最后缓慢升温至室温反应24 h。在这一条件下,以70%的收率得到标题化合物。随后,在碱性条件下水解乙酰基,以83%的收率得到标题化合物。

2,3,5-三-O-苄基-1-O-对硝基苯甲酰基-D-阿拉伯呋喃糖的合成

D-阿拉伯糖经甲基化、苄基化得1-O-甲基-2,3,5-三-O-苄基-D-阿拉伯呋喃糖,再经水解、由对硝基苯甲酰氯酰化制得核苷类药物中间体2,3,5-三-O-苄基-1-O-对硝基苯甲酰基-D-阿拉伯呋喃糖,总收率约45%。

低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性质研究

旨在获得在低温条件下具有高催化能力的低温木糖苷酶,并对其进行异源表达研究和酶学性质分析。利用Touch down PCR和TAIL PCR方法,从枝顶孢菌中克隆得到一个序列新颖的GH43家族双功能木糖苷酶/阿拉伯呋喃糖苷酶基因ax543,该酶基因在毕赤酵母中成功表达。酶学性质分析发现重组酶AX543的最适温度为25℃,在15℃和4℃仍有54%和21%的相对酶活;具有木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶活性,并可以降解木二糖、木三糖、桦木木聚糖、榉木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖;可以与木聚糖酶Xyn11-1协同作用,协同度达1.46;具有高木糖/阿拉伯糖耐受性,抑制常数Ki分别为84.78 mmol/L和54.01 mmol/L。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响

PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe^(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。

阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及其发酵工艺优化

将来源于草酸青霉菌(Penicillium oxalicum sp.68)的阿拉伯呋喃糖苷酶基因poabf62a进行密码子优化后,在毕赤酵母GS115中重组表达PoAbf62A酶,并分析酶学性质。为进一步提高重组蛋白表达量,通过单因素及响应面分析法优化了重组菌株产PoAbf62A酶的发酵工艺。结果表明,以对硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrobenzene-L-arabinofuranoside,p NPAF)为底物时,重组阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A的最适反应pH值为4.5,最适反应温度为40℃;该酶在pH 4.5和40~45℃下较稳定;Al 3+、Co 2+、Zn 2+、Mg 2+等金属离子对该酶活性有促进作用,Fe 3+、Mn 2、Cu 2+和Fe 2+可抑制其活性;以p NPAF为底物测得酶的K m值为2.46 mmol/L,最大反应速度V max为9.05μmol/(min·g),k cat为0.22 s-1。最佳发酵参数为:BMMY培养基中接种量初始OD 600值为2.4,添加诱导剂甲醇的体积分数为1.05%,每24 h补加甲醇使甲醇的体积分数恒定,30.5℃发酵120 h,发酵液酶活力为0.51 U/mL,相比未优化前提高了3.25倍。

一个来源于稻平脐蠕孢的α-阿拉伯呋喃糖苷酶

旨在获得能降解玉米糠木聚糖的阿拉伯呋喃糖苷酶,并对其进行异源表达和酶学性质分析。稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)是重要的植物病原菌,它编码、分泌糖苷水解酶降解植物的木质纤维素利于侵袭感染。从稻平脐蠕孢中克隆得到一个新的GH43家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因BoAra43A并将其在大肠杆菌中成功表达。分析发现重组酶BoAra43A的最适温度为50℃,在40℃处理2 h后活力还剩90.6%活性;最适pH为5.0,在pH 3.0-9.0比较稳定,可保持80%以上的酶活力。BoAra43A可降解富含侧链的异质性木聚糖如小麦阿拉伯木聚糖(WAX)、玉米糠(CX)及其碱提物(CX-NaOH)和寡糖如A2,3XX、XA2,3XX、AA2,3AA/AAA3A中的阿拉伯糖,推断其能降解阿拉伯糖双取代的木聚糖中α-(1→3)连接的阿拉伯糖。PsAra43A是来源于Paenibacillus sp.E18的GH43阿拉伯呋喃糖苷酶,降解异质性木聚糖上的单取代阿拉伯糖侧链。使用BoAra43A预先处理CX、再和阿拉伯呋喃糖苷酶PsAra43A反应,两种酶之间具有较强的协同作用,协同度为1.34。

一种黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶克隆表达、性质分析和果汁澄清效果

利用基因重组技术克隆黑曲霉(Aspergillus niger)的1887 bpα-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在毕赤酵母SMD1168中诱导表达获得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。结果表明,重组蛋白大小为85 kDa,纯化后其比活力为55.73 U/mg;最适反应温度和pH值分别为65℃和5.0;金属离子K^(+)对该酶活力有促进作用,而Cu^(2+)对酶活力有明显抑制作用;以4-硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷为底物时测得K_(m)值和V_(max)值分别为2.31 mmol/L和625μmol/(mL·min);该酶对柑橘果汁具有显著澄清效果。本研究不仅丰富了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源库,同时为后续探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果汁加工中的应用提供了参考。

玉米皮纤维发酵培养裂褶菌的转录组分析和重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的异源表达

玉米皮是玉米淀粉加工的副产物,玉米皮纤维降解酶的开发对提高玉米皮的利用价值有重要意义。通过测定玉米皮纤维为唯一碳源发酵培养裂褶菌的转录组,共获得23656个Unigene,平均GC含量为0.5897。序列分析显示共有5个木聚糖酶基因,分别属于糖苷水解酶第10家族和第11家族;有6个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,分别属于糖苷水解酶第43、51和62家族。克隆了糖苷水解酶62家族蛋白基因Sabf32,该蛋白编码序列全长975 bp,N端有21个氨基酸的信号肽序列;完成了Sabf32在毕赤酵母中的表达,并验证了Sabf32的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化活性,其最适温度为40℃,最适pH为4.0,在pH 3.5~5.5和40℃下较稳定;Sabf32比酶活力为16.18 U/mg,Km和Vmax分别为(3.98±0.32)mmol/L和(2.59±0.09)μmol/(min·mg)。

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。

HPLC同时测定鹿衔草提取物中香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素的含量

目的:建立HPLC同时测定鹿衔草提取物中香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素的含量。方法:色谱柱:Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)柱,流动相:乙腈-0.1%醋酸水,梯度洗脱;柱温:35℃,流速:1.0 ml·min^-1,检测波长:255 nm。结果:香草酸、金丝桃苷、槲皮素-3-O-呋喃阿拉伯糖苷、槲皮素和梅笠草素分别在3.71~148.40μg·ml^-1(r=0.999 9)、5.92~236.70μg·ml^-1(r=0.999 8)、3.36~134.25μg·ml^-1(r=0.999 8)、3.94~157.80μg·ml^-1(r=0.999 9)和3.10~124.15μg·ml^-1(r=0.999 8)范围内线性关系良好,平均回收率分别为99.01%、98.80%、98.48%、98.71%和98.62%,RSD分别为0.95%、1.15%、1.36%、0.94%和1.02%(n=6)。结论:该方法快捷简便、准确性及重复性均良好,可用于鹿衔草提取物及相关制剂质量的评价和控制。

响应面法优化离子交换法固定化β-D-呋喃果糖苷酶

以大孔阴离子树脂D311为载体,对日本曲霉来源的β-D-呋喃果糖苷酶进行离子交换法固定化。研究温度、pH值、时间、游离酶液酶活力对固定化效果的影响,并在此基础上运用响应面法对固定化条件进行优化。结果表明,最佳固定化条件为:室温、pH6.6、固定化时间4h、游离酶液酶活力为900U/mL,在此条件下,固定化β-D-呋喃果糖苷酶生产的低聚果糖产量可达58.16%。

日本曲霉产β-D-呋喃果糖苷酶的固定化

采用海藻酸钠包埋法、明胶-海藻酸钠复合包埋法和戊二醛-海藻酸钠共价交联法分别对日本曲霉来源的β-D-呋喃果糖苷酶进行固定化研究。实验结果发现:当海藻酸钠溶液浓度为3g/100mL,游离酶液酶活为800U/mL,CaCl2溶液浓度为1g/100mL,固定化时间为20min,制备的固定化酶酶活回收率为54.32%;添加浓度为3g/100mL明胶进行复合包埋后,其固定化酶酶活回收率达到69.23%;与0.3g/100mL戊二醛进行共价交联15min,制备的固定化酶酶活回收率为62.31%,反应10批相对酶活回收率仍在80%以上。从实际生产应用、固定化酶酶活、固定化酶的操作稳定性等方面综合比较,戊二醛-海藻酸钠交联法较佳。