在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位的研究

目的在大肠杆菌中以可溶性形式表达鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3 GTcd;catalytic do-main ofα1,3GT),利用其在人消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位(Galα1-3Gal-β1-4GlcNAc-R),拟用来制备一种新的自体肿瘤疫苗。方法利用pET-15 b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3 GTcd,利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性。通过其在人不同消化道肿瘤细胞表面构建α-gal表位,先与人血清孵育,FITC标记的羊抗人的IgG为第二抗体,用流式细胞仪检测荧光强度,以分析α-gal表位的表达结果。结果可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd并利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3 GTcd的活性。流式细胞仪检测结果证明了在人消化道肿瘤细胞表面成功构建了α-gal表位。结论本研究可溶性的表达了α1,3 GTcd,并利用其在人消化道肿瘤细胞表面成功地构建了α-gal表位.为该方法的临床治疗的应用打下坚实的基础。

肿瘤特异性锚定型α-gal模拟表位真核表达质粒的构建及功能研究

目的构建Survivin启动子调控的、α-gal模拟表位序列和GPI锚定序列融合基因的真核表达质粒,研究该质粒在肺癌A549细胞表面锚定表达α-gal模拟表位及其抗肺癌细胞效应。方法 PCR法扩增gal-GPI融合基因,以pSGFP质粒为载体,构建Survivin启动子调控的pSGFP-gal-GPI真核表达质粒。将其用脂质体瞬时转染A549细胞后,用荧光显微镜观察GPI锚定表达功能,分别用免疫组化法和Western-blot法对锚定表达的α-gal模拟表位进行定位和免疫反应性分析,并用新鲜人血清对表达α-gal模拟表位的A549细胞进行补体介导的溶细胞效应研究。结果 pSGFP-gal-GPI质粒转染细胞的绿色荧光不均匀分布在细胞膜周围,免疫细胞化学分析表明重组融合蛋白表达在细胞膜上,Western-blot结果表明重组融合蛋白与人IgG有良好的免疫反应性;人新鲜血清对表达该表位的A549细胞具有明显的溶细胞效应。结论成功构建了能在A549细胞膜锚定表达α-gal模拟表位的pSGFP-gal-GPI真核表达质粒,为肺癌等靶向基因治疗奠定了基础。

鼠源性α-1,3-半乳糖基转移酶催化结构域的表达及纯化

目的:表达和纯化鼠源性的α-1,3-半乳糖基转移酶的催化结构域(α1,3GTcd)以及为在肿瘤细胞表面生成α-gal表位提供了可行性手段。方法:利用pET-15b载体以可溶性形式表达鼠源性α1,3GTcd。利用高效液相色谱阴离子交换柱检测酶的活性。结果:①成功地构建了带有His-tag的α1,3GTcd重组质粒。②可溶性高效表达与纯化了带有His-tag的α1,3GTcd。③利用HPLC阴离子交换柱检测α1,3GTcd的活性。结论:可溶性地表达了α1,3GTcd。

猪α-1,3-半乳糖转移酶基因打靶载体的构建

目的:构建猪α-1,3-半乳糖转移酶(GGTA1)基因的正负筛选打靶载体。方法:以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段;以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂,在XbaⅠ和ClaⅠ位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3'端;以长约5.4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂,于NotⅠ位点插入该质粒中neo基因的5'端;2.7kb的负筛选标记tk基因位于载体中同源短臂的3'端外侧。结果与结论:酶切、PCR及测序结果表明,同源臂被正确连接至质粒pLoxP,成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL/GT。

利用正负筛选打靶载体在猪肾细胞系PK-15细胞中敲除GGTA1基因

目的半乳糖-α1,3-半乳糖(αGal)表位是猪到人异种移植中引起排斥反应的主要异种抗原。通过同源重组敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因可从异种移植物表面彻底清除αGal表位。本研究的目的在于利用正负筛选打靶载体定向缺失猪GGTA1基因。方法构建猪α1,3-半乳糖基转移酶基因正负筛选打靶载体pSL/GT,载体包含了正负筛选标记基因neo和tk,打靶载体线性化后用脂质体包裹转染猪肾细胞系PK-15细胞,利用G418和GANC进行抗性细胞克隆的药物筛选,挑选抗性克隆进行PCR及Southern杂交鉴定。结果共得到436个抗性细胞克隆,其中31个克隆PCR结果阳性。经Southern杂交鉴定证实,其中1个克隆发生了同源重组,为杂合子。结论本研究构建了有效的猪GGTA1基因的正负筛选打靶载体pSL/GT,并利用其在猪肾细胞系PK-15细胞中定向缺失GGTA1基因,获得了杂合子GGTA1(+/-)PK-15细胞。