微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究进展

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Alpha-L-arabinofuranosidase,α-L-AFase)属于糖苷水解酶类,主要功能是水解阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖取代基,并与其他水解酶协同促进半纤维素的降解,从而改善半纤维素的生物转化率。本文综述了近年来微生物来源α-L-AFase的酶学特性、性质改良、结构、催化机制和协同作用效应等方面的研究进展,发现不同微生物来源的α-L-AFase的理化性质、分子结构和催化机制均存在着多样性,重组表达的方法能有效改善α-L-AFase的活性和稳定性,且α-L-AFase与其他半纤维素水解酶的协同催化作用使底物的转化效率显著提高。α-L-AFase广泛应用于改善面团发酵质地、果汁澄清、酿酒工艺优化、制备高消化率饲料以及功能性保健产品研制等多个领域。本文为后续α-L-AFase的基础研究、开发和利用提供一定的参考。

蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用

通过鉴定筛选得到1株高产β-葡萄糖苷酶的长白山虫草属真菌蛹虫草。研究碳源、氮源及pH值对菌株产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸与生物量的影响规律,从而获得高产生物活性物质的培养条件,并对蛹虫草转化人参皂苷Rg1与Rc的路径与转化率进行了研究。采用紫外检测法测定β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力,超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法鉴定转化产物中人参皂苷的组成,利用高效液相色谱法测定虫草素含量及人参皂苷的转化率。结果表明:蛹虫草在碳源为纤维二糖、氮源为牛肉膏、pH 8、培养120 h条件下有较高β-葡萄糖苷酶活力((74.70±0.09)U/mL)。在碳源为乳糖、氮源为蛋白胨、pH 4、培养72 h条件下有最高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力((11.55±0.01)U/mL)。蛹虫草转化人参皂苷Rg1的路径为Rg1→Rh1和Rg1→F1,转化Rc路径为Rc→Rd→Rg3→CK和Rc→CMc。经过168 h的转化,人参皂苷Rg1转化率为54.9%,Rc转化率达到83.44%。本研究为提高药食两用真菌蛹虫草生物转化人参皂苷效率提供了理论基础,也为蛹虫草和人参食品、药品开发提供了一定理论支持。

桃果实成熟软化过程中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性和乙烯合成相关因子的变化

以‘雨花三号’水蜜桃果实为试材,采用气相色谱法测定了桃果实成熟过程中乙烯释放量、氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶活性和ACC含量的变化,同时分析了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Afa)活性的变化。探讨了乙烯合成的相关因子和α-Afa对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,乙烯释放量、ACC氧化酶活性和ACC含量同时于成熟度Ⅳ出现高峰,α-Afa活性在成熟前期变化平缓,而在成熟中后期明显上升。本实验初步探明了α-Afa与乙烯的相互作用关系及其对桃果实成熟后期快速软化的作用机理。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响

PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe^(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。

一种黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶克隆表达、性质分析和果汁澄清效果

利用基因重组技术克隆黑曲霉(Aspergillus niger)的1887 bpα-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在毕赤酵母SMD1168中诱导表达获得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。结果表明,重组蛋白大小为85 kDa,纯化后其比活力为55.73 U/mg;最适反应温度和pH值分别为65℃和5.0;金属离子K^(+)对该酶活力有促进作用,而Cu^(2+)对酶活力有明显抑制作用;以4-硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷为底物时测得K_(m)值和V_(max)值分别为2.31 mmol/L和625μmol/(mL·min);该酶对柑橘果汁具有显著澄清效果。本研究不仅丰富了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源库,同时为后续探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果汁加工中的应用提供了参考。

玉米皮纤维发酵培养裂褶菌的转录组分析和重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的异源表达

玉米皮是玉米淀粉加工的副产物,玉米皮纤维降解酶的开发对提高玉米皮的利用价值有重要意义。通过测定玉米皮纤维为唯一碳源发酵培养裂褶菌的转录组,共获得23656个Unigene,平均GC含量为0.5897。序列分析显示共有5个木聚糖酶基因,分别属于糖苷水解酶第10家族和第11家族;有6个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,分别属于糖苷水解酶第43、51和62家族。克隆了糖苷水解酶62家族蛋白基因Sabf32,该蛋白编码序列全长975 bp,N端有21个氨基酸的信号肽序列;完成了Sabf32在毕赤酵母中的表达,并验证了Sabf32的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化活性,其最适温度为40℃,最适pH为4.0,在pH 3.5~5.5和40℃下较稳定;Sabf32比酶活力为16.18 U/mg,Km和Vmax分别为(3.98±0.32)mmol/L和(2.59±0.09)μmol/(min·mg)。

Bacillus pumilus阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及水解木聚糖的研究

从短小芽孢杆菌中克隆阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43并重组表达,有利于将该酶分离纯化后应用于其他半纤维素多糖的水解。该研究利用E.coli BL21表达系统对实验室克隆到的短小芽孢杆菌的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因xyn43进行重组表达并分析其酶学性质,将重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43和来源于棒曲霉突变菌株的商业木聚糖酶联合作用于燕麦木聚糖。结果表明:以燕麦木聚糖为底物,重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Xyn43的最适温度为50℃,最适p H为6.0。该酶在p H 5.0~10.0和45~55℃下较稳定。与木聚糖酶单独作用相比,重组Xyn43酶与商业木聚糖酶同时加入以及先用木聚糖酶水解后加入Xyn43酶,水解产物中的还原糖含量分别增加了16%和20%,木糖含量增加了35%和48%。该结果研究结果表明重组Xyn43酶能够和商业木聚糖酶协同降解燕麦木聚糖,提高水解效率,产生更多的木寡糖,阿拉伯糖和木糖。

西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组来源的高比活α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的重组表达及酶学性质

【背景】α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是一类重要的半纤维素酶,能协同其他半纤维素酶降解木聚糖,在食品、医药、生物质能转化中具有应用价值。【目的】挖掘新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,对其进行异源表达、纯化并研究其酶学性质。【方法】从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中扩增α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,并进行酶学性质研究。【结果】从粪便微生物宏基因组中扩增得到α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfNC2b_38,并获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶AbfNC2b_38,其分子量为57.04 kDa。AbfNC2b_38的最适作用条件为55℃、pH 6.0,Km和Vmax分别为(6.48±0.73)mmol/L和(1248.0±114.6)U/mg,与其他宏基因组来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶相比具有最高比活300.81U/mg。AbfNC2b_38具有较好的乙醇和NaCl耐受性,30%乙醇下耐受1 h保持68%的活性;25%NaCl中耐受1 h,相对酶活仍保持在约70%。与木聚糖酶协同降解山毛榉木聚糖时,协同率最高为1.21。【结论】从西黑冠长臂猿粪便微生物宏基因组中获得新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因AbfNC2b_38并成功异源表达。AbfNC2b_38具有较好的乙醇和NaCl耐受性,能与木聚糖酶协同作用提高木聚糖的降解效率,在饲料、食品加工等领域具有潜在的应用价值。

桃果实成熟软化与细胞壁降解相关糖苷酶及乙烯生物合成的关系

【目的】研究不同溶质型桃成熟软化过程中β-半乳糖苷酶(β-Gal)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Af)以及乙烯生物合成相关酶(ACC氧化酶ACO和ACC合成酶ACS)的变化。【方法】采用气相色谱测定乙烯释放量;采用常规理化分析方法测定相关酶活性;采用RT-PCR研究相关酶的定性表达,同时采用Real-time PCR分析其表达量的变化。【结果】不同桃品种之间软化特性存在较大差异,‘雨花3号’桃果实成熟过程中,随着果实硬度下降,乙烯释放量明显增加并出现峰值,‘加纳岩’桃果实在成熟过程中一直保持相对较高的硬度且乙烯释放量很低,其最高值不及‘雨花3号’桃果实乙烯释放量的1%;β-Gal基因表达量和活性在桃果实成熟软化前期较高,α-Af基因表达和活性在成熟软化后期较高,且α-Af的快速变化期滞后于乙烯及其合成相关酶的变化。【结论】β-Gal酶对桃果实早期阶段的软化启动有较大影响,且两类桃果实β-Gal基因表达和β-Gal活性可能存在不同的诱导机制;α-Af对桃果实成熟中后期快速软化影响更显著且α-Af的激活与果实内源乙烯的积累密切相关。

新型α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶RuAra1的表达与鉴定

随着能源问题的日益突出,半纤维素资源的利用逐渐受到人们的重视.α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Larabinofuranosidase,EC 3.2.1.55)属于半纤维素酶系,能水解以α-1,3、α-1,2或α-1,5键连在木聚糖主链上的阿拉伯糖单体或低聚阿拉伯糖侧支.本实验室将克隆得到的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因RuAral在大肠杆菌中重组表达,得到的重组阿拉伯呋喃糖苷酶RuAral能够水解4-硝基酚-α-L-阿拉伯糖苷(4-Nitrophenyl-α-Larabinofuranoside,pNPA)、4-硝基酚-β-D-吡喃木糖苷(4-Nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,pNPX)以及从小麦阿拉伯木聚糖中水解释放阿拉伯单糖.以pNPX为底物时,该酶的最适反应pH为6.0,最适反应温度为50℃.RuAral与瘤胃真菌(Neocallimastix patriciarum)内切木聚糖酶XynCIDBFV、瘤胃细菌木糖苷酶RuXynl的组合使用可以实现对小麦阿拉伯木聚糖的协同降解,且降解效率优于德国AB酶制剂公司的商品酶ROHALASE WP.

1-MCP处理对桃果实成熟软化及其α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性和基因表达的影响

本研究以软溶质型桃果实‘雨花三号’和硬溶质型桃果实‘加纳岩’为材料,研究了1-甲基环丙烯(1-MCP)处理对两种不同溶质型桃果实成熟软化过程中的基本生理变化及细胞壁多糖降解相关的重要酶α-阿拉伯呋喃糖苷酶的影响,为进一步研究核果类果实成熟软化机理提供理论依据。主要研究结果如下:1-MCP有效延缓了‘雨花三号’和‘加纳岩’桃果实硬度的下降,抑制了‘雨花三号’贮藏前8 d的乙烯释放,对‘加纳岩’乙烯释放的抑制主要表现在贮藏4 d后。1-MCP处理后对不同溶质型桃果实呼吸速率具有一定的抑制作用,但对‘雨花三号’的抑制表现在贮藏前10 d,而对‘加纳岩’的抑制表现在贮藏6 d后。1-MCP处理后α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因和酶活性受到抑制,对‘雨花三号’和‘加纳岩’桃果实贮藏6 d和12 d时酶活性的抑制率均达50%左右,果实软化延迟,进一步证明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶作用于细胞壁的降解受乙烯调控。

1-甲基环丙烯对桃果实成熟软化调控的影响

以“雨花三号”桃果实为试材,研究了1-甲基环丙烯(1-MCP)处理后对桃果实乙烯生物合成途径和细胞壁降解相关酶的影响。结果表明:1-MCP处理能够延缓果实后熟软化进程,降低了桃果实乙烯释放量,并抑制了果实快速软化阶段的ACC氧化酶(ACO)的活性;对多聚半乳糖醛酸酶(PG)和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-AF)活性均表现一定的抑制作用。