微生物来源的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的研究进展

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(Alpha-L-arabinofuranosidase,α-L-AFase)属于糖苷水解酶类,主要功能是水解阿拉伯木聚糖中的阿拉伯糖取代基,并与其他水解酶协同促进半纤维素的降解,从而改善半纤维素的生物转化率。本文综述了近年来微生物来源α-L-AFase的酶学特性、性质改良、结构、催化机制和协同作用效应等方面的研究进展,发现不同微生物来源的α-L-AFase的理化性质、分子结构和催化机制均存在着多样性,重组表达的方法能有效改善α-L-AFase的活性和稳定性,且α-L-AFase与其他半纤维素水解酶的协同催化作用使底物的转化效率显著提高。α-L-AFase广泛应用于改善面团发酵质地、果汁澄清、酿酒工艺优化、制备高消化率饲料以及功能性保健产品研制等多个领域。本文为后续α-L-AFase的基础研究、开发和利用提供一定的参考。

蛹虫草产β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性分析及转化人参皂苷Rg1与Rc应用

通过鉴定筛选得到1株高产β-葡萄糖苷酶的长白山虫草属真菌蛹虫草。研究碳源、氮源及pH值对菌株产β-葡萄糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、虫草酸与生物量的影响规律,从而获得高产生物活性物质的培养条件,并对蛹虫草转化人参皂苷Rg1与Rc的路径与转化率进行了研究。采用紫外检测法测定β-葡萄糖苷酶与α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力,超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法鉴定转化产物中人参皂苷的组成,利用高效液相色谱法测定虫草素含量及人参皂苷的转化率。结果表明:蛹虫草在碳源为纤维二糖、氮源为牛肉膏、pH 8、培养120 h条件下有较高β-葡萄糖苷酶活力((74.70±0.09)U/mL)。在碳源为乳糖、氮源为蛋白胨、pH 4、培养72 h条件下有最高的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力((11.55±0.01)U/mL)。蛹虫草转化人参皂苷Rg1的路径为Rg1→Rh1和Rg1→F1,转化Rc路径为Rc→Rd→Rg3→CK和Rc→CMc。经过168 h的转化,人参皂苷Rg1转化率为54.9%,Rc转化率达到83.44%。本研究为提高药食两用真菌蛹虫草生物转化人参皂苷效率提供了理论基础,也为蛹虫草和人参食品、药品开发提供了一定理论支持。

桃果实成熟软化过程中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性和乙烯合成相关因子的变化

以‘雨花三号’水蜜桃果实为试材,采用气相色谱法测定了桃果实成熟过程中乙烯释放量、氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶活性和ACC含量的变化,同时分析了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-Afa)活性的变化。探讨了乙烯合成的相关因子和α-Afa对桃果实成熟软化的影响。结果表明:在桃果实成熟软化过程中,乙烯释放量、ACC氧化酶活性和ACC含量同时于成熟度Ⅳ出现高峰,α-Afa活性在成熟前期变化平缓,而在成熟中后期明显上升。本实验初步探明了α-Afa与乙烯的相互作用关系及其对桃果实成熟后期快速软化的作用机理。

重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-L-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-L-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺:诱导前比生长速率0.2 h^(-1),诱导后比生长速率0.18 h^(-1),诱导温度33℃,pH 7.2。在最佳发酵工艺条件下,乙酸浓度始终保持在0.8 g/L以下,菌体干重(DCW)最大为69.6 g/L,最高酶活力为589.0 U/mL,是摇瓶发酵的23.4倍,实现了重组大肠杆菌高密度发酵生产TstRhaA。研究结果表明,调节大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸含量在合适范围内,能够实现TstRhaA的高效生产,这对其他酶的高密度表达具有重要指导意义。

血清α-L-岩藻糖苷酶、甲胎蛋白、异常凝血酶原检测在原发性肝癌诊断中的价值研究

目的分析在诊断原发性肝癌患者时采取血清α-L-岩藻糖苷酶(α-l-fucosidase,AFU)、甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)、异常凝血酶原Ⅱ(Protein Induced by Vitamin K Absence or Antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)检测的价值。方法选取2022年8月—2023年8月邳州市中医院收治的83例原发性肝癌患者以及肝硬化患者作为研究对象,依据疾病类型不同,分为良性组(肝硬化患者41例)、观察组(原发性肝癌患者42例),另选择83例健康人群作为对照组。检测3组血清AFU、AFP、PIVKA-Ⅱ指标,分析上述指标水平,同时通过ROC曲线分析单项以及联合检测诊断原发性肝癌的价值。结果两组患者AFU、AFP、PIVKA-Ⅱ指标均显著高于对照组,且观察组AFU、AFP、PIVKA-Ⅱ指标水平高于良性组,差异有统计学意义(P均<0.05)。联合检测时,AUC提升至0.912,灵敏度提升至89.63%,特异度提升至99.10%,高于单独检测。结论在诊断原发性肝癌患者中,采用联合AFU、AFP、PIVKA-Ⅱ检测方式,有较为理想的诊断价值,能够为完善治疗方案奠定基础,可以作为诊断原发性肝癌的有效方法之一。

香蕉果实成熟软化时果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的变化(英文)

阿拉伯糖是果实软化过程中变化最明显的细胞壁糖残基之一,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶是导致细胞壁多糖中阿拉伯糖残基降解的主要糖苷酶。为阐明该酶在香蕉果实成熟软化中的作用,实验对香蕉贮藏过程中果皮和果肉中该酶活性以及果实硬度、呼吸强度和乙烯释放量的变化进行了研究。结果表明:α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果实初期的变化很小,到果实硬度开始急剧下降时达到最大,增加量达10倍以上,且果肉中的酶活性大于果皮中;乙烯吸收剂处理延缓了香蕉果实呼吸和乙烯高峰的出现时间,降低了果实硬度、果皮和果肉中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性变化的速度和幅度。以上结果表明α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶起诱导香蕉果实成熟的作用,在果实的软化中起着十分重要的作用,且其活性受乙烯的调节。

车前子壳诱导木聚糖酶与阿拉伯糖苷酶协同制备

该研究以车前子壳为诱导底物,采用单因素试验和响应面试验对里氏木霉(Trichoderma reesei)诱导木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶的协同制备条件进行优化。单因素试验结果表明,在诱导碳源为车前子壳,初始pH为5.0、底物质量浓度为20 g/L、培养时间为4.0 d、碳氮比为1.6∶1.0时,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力最高,分别为(10.59±0.33)IU/mL和(8.99±0.05)IU/mL。响应面试验结果表明,最佳产酶条件为培养时间4.0 d、底物质量浓度20 g/L、碳氮比1.6∶1.0。在此最佳条件下,木聚糖酶和阿拉伯糖苷酶活力分别为(11.42±0.15)IU/mL和(10.83±0.08)IU/mL,分别是未优化前的2.55倍和7.37倍。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响

PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe^(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。

慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化和原发性肝癌患者血清腺苷脱氨酶、α-L-岩藻糖苷酶和AFP-L3水平变化及其临床意义探讨

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)、乙型肝炎肝硬化(LC)和乙型肝炎相关性原发性肝癌(PLC)患者血清腺苷脱氨酶(ADA)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)和甲胎蛋白-L3(AFP-L3)水平变化及其临床意义。方法2020年1月~2022年4月我院诊治的CHB患者76例、LC患者31例和乙型肝炎相关性PLC患者29例,采用酶比色法检测血清ADA水平,采用速率法检测血清AFU水平,采用ELISA检测血清AFP-L3水平。对CHB患者常规行肝活检术。应用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清指标诊断PLC的效能。结果46例G2~G4的CHB患者血清ADA、AFU和AFP-L3水平分别为(29.6±5.1)μ/L、(34.7±5.0)μ/L和(6.9±1.2)%,显著高于30例G0/G1的CHB患者【分别为(25.4±3.9)μ/L、(29.5±5.2)μ/L和(5.8±0.8)%,P<0.05】,55例S2~S4的CHB患者血清ADA、AFU和AFP-L3水平分别为(43.8±10.1)μ/L、(66.5±18.8)μ/L和(8.3±1.3)%,显著高于21例S0/S1的CHB患者【分别为(28.1±6.0)μ/L、(33.0±8.4)μ/L和(6.4±1.1)%,P<0.05】;PLC患者血清ADA、AFU和AFP-L3水平分别为(51.3±5.2)μ/L、(82.0±9.5)μ/L和(9.2±1.3)%,显著高于LC患者【分别为(38.1±4.6)μ/L、(51.8±5.1)μ/L和(7.8±1.1)%,P<0.05】或CHB患者【分别为(26.5±4.6)μ/L、(30.9±5.6)μ/L和(6.1±0.8)%,P<0.05】;分别以血清AFP-L3=7.9%、AFU=55.1μ/L和ADA=46.0μ/L为截断点,AFP-L3诊断PLC的AUC为0.857,其灵敏度为86.2%,特异度为88.8%,显著优于AFU(分别为0.752、79.3%和77.6%)或ADA(分别为0.722、75.8%和76.6%,P<0.05)。结论应用血清AFP-L3水平诊断乙型肝炎患者罹患PLC的效能显著高于血清ADA或AFU水平,值得临床进一步验证。

一种黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶克隆表达、性质分析和果汁澄清效果

利用基因重组技术克隆黑曲霉(Aspergillus niger)的1887 bpα-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,在毕赤酵母SMD1168中诱导表达获得α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。结果表明,重组蛋白大小为85 kDa,纯化后其比活力为55.73 U/mg;最适反应温度和pH值分别为65℃和5.0;金属离子K^(+)对该酶活力有促进作用,而Cu^(2+)对酶活力有明显抑制作用;以4-硝基苯酚-α-L-阿拉伯呋喃糖苷为底物时测得K_(m)值和V_(max)值分别为2.31 mmol/L和625μmol/(mL·min);该酶对柑橘果汁具有显著澄清效果。本研究不仅丰富了α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶资源库,同时为后续探究α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在果汁加工中的应用提供了参考。

玉米皮纤维发酵培养裂褶菌的转录组分析和重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的异源表达

玉米皮是玉米淀粉加工的副产物,玉米皮纤维降解酶的开发对提高玉米皮的利用价值有重要意义。通过测定玉米皮纤维为唯一碳源发酵培养裂褶菌的转录组,共获得23656个Unigene,平均GC含量为0.5897。序列分析显示共有5个木聚糖酶基因,分别属于糖苷水解酶第10家族和第11家族;有6个α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,分别属于糖苷水解酶第43、51和62家族。克隆了糖苷水解酶62家族蛋白基因Sabf32,该蛋白编码序列全长975 bp,N端有21个氨基酸的信号肽序列;完成了Sabf32在毕赤酵母中的表达,并验证了Sabf32的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶催化活性,其最适温度为40℃,最适pH为4.0,在pH 3.5~5.5和40℃下较稳定;Sabf32比酶活力为16.18 U/mg,Km和Vmax分别为(3.98±0.32)mmol/L和(2.59±0.09)μmol/(min·mg)。

阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性

阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶是木聚糖类半纤维素生物降解和转化所必需的酶类。本文在国内首次报道对该酶的研究 :通过PCR从产乙醇热厌氧杆菌ThermoanaerobacterethanolicusJW2 0 0克隆出编码高度热稳定性阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因 ,与组氨酸标签融合 ,以高拷贝质粒pAlter Ex1在大肠杆菌中得到高效表达 ;基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,得到的阿拉伯呋喃糖苷酶在pH4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,75℃的半衰期为 1h ;β 木糖苷酶在pH 5 .0～ 8.2之间有较高的稳定性 ,酶 1h半衰期温度为 84℃。

假密环菌cDNA文库的构建及其阿拉伯糖苷酶基因的克隆(英文)

用SMART技术构建了载体为λTriplEx2的假密环菌的表达型cDNA文库。文库滴度为1.0×106pfu/ml,重组率约为98.3%,扩增后滴度为3.1×1 08pfu/ml,容量约为4.2×1010。从文库中随机挑选176个克隆进行5’端测序,得到147条表达序列标签(EST),并将测序结果提交到EMBL数据库。随机测序结果表明:插入片段长度均在200-800之间。测序结果经过生物信息学分析,发现有43 条序列与已知序列有明显同源性,其中序列AJ620046与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列有很高的序列一致性。用SMART-RACE技术成功获得了AJ620046的全长cDNA,克隆了AJ620046的开放阅读框AF,并成功构建了重组质粒pHIL-S1-AF,在毕赤酵母菌中进行了初步表达。

热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化

α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶对来源于被子植物的木聚糖类半纤维素的生物降解和转化是必不可少的。文中首次报道了国内对该酶的研究。α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因工程菌在发酵罐中以LB为基质进行生长 ,以乳糖为诱导剂 ,所产生的α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶在 70℃热处理 3 0min后、经DEAE Sephacel阴离子柱层析、金属Ni2 + 的亲和层析等提纯步骤 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 49 3倍 ,收率为 2 0 4%。SDS PAGE法测定α 阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的分子质量为 85ku 。

极耐热性阿拉伯糖苷酶在木糖制备中的应用

阿拉伯糖苷酶作为木聚糖降解的限速酶之一,在植物残体的生物转化、食品加工、饲料工业以及纸浆漂白中具有广泛的应用潜力。实验中选择pET—28a作为表达载体,优化核糖体结合位点RBS与起始密码子ATG间距离,使来自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)极耐热性阿拉伯糖苷酶得到高效表达,重组酶蛋白经一步热处理后纯度达到90%以上;木聚糖酶解试验结果表明,阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶间存在协同作用;阿拉伯糖苷酶与木聚糖酶和β-木糖苷酶联合水解木聚糖能明显提高酶解产物中木糖含量,因此,开发极耐热性阿拉伯糖苷酶在酶法制备木糖中的应用具有重要的经济效益和社会效益。

极耐热性阿拉伯糖苷酶基因的表达、纯化及酶学性质研究

采用PCR从海栖热袍菌 (Thermotogamaritima)克隆出编码极耐热稳定性阿拉伯糖苷酶基因 ,以pET 2 0b为表达质粒 ,与其C末端 6个组氨酸标签序列融合 ,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过热处理和亲和层析柱纯化后 ,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶稳定性检测表明 ,阿拉伯糖苷酶活性最适作用温度和最适作用pH分别为 90～ 95℃和pH 5 .0～ 5 .5 ,在pH 4 .2～ 8.2之间酶活力稳定 ,95℃的半衰期为 4h ;SDS PAGE测得酶的分子量为 5 6 .5 7kD ,与理论推算值相吻合。在所测定的底物中 ,阿拉伯糖苷酶仅对对硝基苯 阿拉伯呋喃糖苷 (pNPAF)有专一性水解作用 ,其动力学参数Km 值为 0 18mmol L ,Vmax为 139μmol min·mg。

血清甲胎蛋白、α-L-岩藻糖苷酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、乳酸脱氢酶检测对肝癌的诊断价值

目的探究血清甲胎蛋白(AFP)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)在肝癌中的诊断价值。方法回顾性分析2019年8月至2021年4月福建医科大学附属第二医院收治的88例肝脏病变患者的临床资料,将34例肝癌患者纳入肝癌组,另将54例肝脏良性病变者纳入良性肝病组。采集所有血液标本,检测血清AFP、AFU、ALP、GGT、LDH水平。比较两组患者各血清肿瘤标志物水平,以病理组织学检查结果作为“金标准”,分析各血清肿瘤标志物水平在肝癌中的诊断价值,另计算各血清肿瘤标志物与病理结果的一致性。结果肝癌组AFP、AFU、ALP、GGT、LDH水平均高于良性肝病组,差异有统计学意义(P<0.05)。各指标联合检测敏感度、特异度、准确度、阳性预测值及阴性预测值均高于其他单项检测结果,且AFP、LDH与病理结果的一致性不佳,Kappa值分别为0.370、0.032;AFU、ALP、GGT与病理结果一致性尚可,Kappa值分别为0.460、0.505、0.566;联合检测与病理结果一致性良好,Kappa值为0.928。结论各血清肿瘤标志物联合检测在肝癌鉴别诊断中具有较高的临床应用价值,依据各肿瘤标志物水平变化有助于评估患者病情严重程度,且联合检测与病理结果存在较高的一致性,可将其作为诊断肝癌的首选方法,值得推广应用。

Armillariella tabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达

通过对假密环菌(Arm illariella tabescens)的表达cDNA克隆文库进行随机测序,获得一段与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列同源性很高的EST序列(AJ620046).根据获得的EST序列用SMART-RACE技术成功从假密环菌中克隆出了阿拉伯糖苷酶基因的全长cDNA,用生物信息学的方法对所获的序列进行信息学分析.分析结果显示其全长cDNA为1 016 bp,其最长的开放阅读框架为924 bp,编码307个氨基酸,该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高同源性,80~279位氨基酸序列属于阿拉伯糖苷酶超家族,58~184位氨基酸是一个典型的结构功能域,蛋白分子质量预测为32 881 u,等电点为4.59.构建重组质粒pPIC9-AF,并在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了表达,相对酶活达到了81.25%.

利用pHsh载体克隆与表达双活性阿拉伯/木糖苷酶

将来源于嗜热厌氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus JW200)的双活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)构建到新型热激质粒pHsh上,得到重组质粒。将重组质粒pHsh-xarB转入大肠杆菌(Escherichia coli JM109)。SDS-PAGE结果表明,该重组酶的分子量为86 kDa,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性好。