微生物柚苷酶的研究进展

柚苷酶是一种具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶两种酶学活性的酶,在柑橘类产品脱苦、鼠李糖和普鲁宁制备及类固醇的生物转化等方面具有广泛的应用前景。柚苷酶来源广泛,其主要来源为微生物。不同来源柚苷酶的酶学性质往往会存在差异,从而影响其应用领域。系统地从柚苷酶来源、微生物产酶、活力测定、分离纯化与性质、克隆表达、结构、固定化及应用等方面对柚苷酶进行了综述,有助于指导其更好地科学研究和工业化应用。

重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-L-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-L-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺:诱导前比生长速率0.2 h^(-1),诱导后比生长速率0.18 h^(-1),诱导温度33℃,pH 7.2。在最佳发酵工艺条件下,乙酸浓度始终保持在0.8 g/L以下,菌体干重(DCW)最大为69.6 g/L,最高酶活力为589.0 U/mL,是摇瓶发酵的23.4倍,实现了重组大肠杆菌高密度发酵生产TstRhaA。研究结果表明,调节大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸含量在合适范围内,能够实现TstRhaA的高效生产,这对其他酶的高密度表达具有重要指导意义。

甘肃河西走廊葡萄酒产区高产糖苷酶非酿酒酵母菌株筛选及其酿酒适应性分析

为筛选高产糖苷酶的本土非酿酒酵母菌株,以甘肃河西走廊葡萄酒各子产区主栽酿酒葡萄为原料,在自然酒精发酵过程中分离得到912株酵母菌;采用七叶苷培养基进行产β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu)菌株初步筛选,通过对硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)法分别定量测定初筛菌株的β-Glu、α-L-阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase,α-L-Ara)、α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,α-L-Rha)、β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidase,β-Xyl)活力,并对优选菌株进行葡萄酒酿造条件适应性分析。结果表明,HX-1、HX-2、HX-3和HX-4具有较高的糖苷酶活力,经WL培养基形态特征及26S rDNA D1/D2区域序列分析鉴定,HX-1和HX-3为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum),HX-2和HX-4为美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)。各糖苷酶的最适pH值为5.0~6.0,最适温度为40~50℃,高乙醇、高SO_(2)和葡萄糖对酶活力均有抑制作用。在葡萄酒酿造条件下,HX-2和HX-4菌株的β-Glu活力、HX-1菌株的α-L-Rha活力、HX-4菌株的α-L-Ara活力、HX-1和HX-3菌株的β-Xyl活力较高。研究结果可为依据葡萄原料中糖苷类型定向选择增香酿造菌株提供技术支持。

α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷工艺研究

目的研究α-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C制备淫羊藿苷工艺。方法以缓冲液种类、pH值、温度、底物与酶用量比例、反应时间、底物质量浓度为影响因素,朝藿定C转化率、淫羊藿苷得率为评价指标,单因素试验优化制备工艺。再进行放大试验,柱色谱分离得到酶解产物,^(1)H-NMR、^(13)C-NMR对产物进行鉴定。结果最佳条件为磷酸盐缓冲液,pH值4.5,温度50℃,底物与酶用量比例1∶2,反应时间72 h,底物质量浓度2 mg/mL,朝藿定C转化率为88.68%,淫羊藿苷得率为92.65%。在底物质量浓度2 mg/mL、反应体系200 mL条件下,朝藿定C转化率均在88%以上,淫羊藿苷产率均在90%以上,而且几乎无副产物生成。结论该方法反应条件温和,底物质量浓度高,成本低,简便可靠,可为淫羊藿资源综合开发利用、淫羊藿苷绿色工业化生产提供基础。

极耐热α-L-鼠李糖苷酶的性质及其在异槲皮素制备中的应用研究

L-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-L-鼠李糖基,已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-L-鼠李糖苷酶,提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行克隆及大肠杆菌的异源表达,随后测定了系列酶学性质,接着优化了该酶制备异槲皮素的酶法制备工艺。结果表明:重组酶SisRha在90℃下酶活力最佳,具有极好的热稳定性,其在80℃下孵育120 min后酶活力几乎没有损失;最适反应pH为5.5,在pH 4.5~7.0时,pH稳定性良好;重组酶SisRha对人工底物对硝基苯酚鼠李糖糖苷(p NPR)的Km值为(0.15±0.03) mmol/L,Vmax值为(6.26±0.51)U/mg,k_(cat)值为(10.48±0.86) s^(-1);对底物p NPR、芦丁、朝藿定C、柚皮苷、橘皮苷和淫羊藿苷的比活力分别为25.06、11.89、6.74、3.14、2.77、0.42 U/mg。重组酶SisRha转化芦丁生成异槲皮素的适宜工艺为:用酶量0.40 U/mL,在85℃、pH 5.0的条件下反应1 h,可将2 mmol/L芦丁几乎全部转化,摩尔转化率高达98.56%。本研究丰富了现有的α-L-鼠李糖苷酶资源,为嗜热菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基础,同时提供了一种高温转化芦丁制备异槲皮素的方法。

α-L-鼠李糖苷酶的研究进展

α-L-鼠李糖苷酶是一种水解酶,可以作用于α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6以及α1连接的糖苷键,广泛存在于自然界的细菌和真菌中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的结构不同,其催化特性也不尽相同。α-L-鼠李糖苷酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。该文综述了α-L-鼠李糖苷酶的来源、分类、特性及应用等。

微生物来源α-L-鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))是一种水解酶,分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族,其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的(α/α)6桶状结构,它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基,在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用,主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。

密码子优化α-L-鼠李糖苷酶基因在酿酒酵母细胞的表面展示表达及产物的酶学性质

桑树富含黄酮苷类化合物,利用糖苷酶生物转化可有效提高其生物利用度,对挖掘桑树资源的药食用价值具有重要意义。天然来源的糖苷酶催化选择性强,但异源表达量低。以源自黑曲霉(Aspergillus niger)的α-L-鼠李糖苷酶基因rha为目的基因,改善该基因的密码子偏爱性和适应性,将密码子优化后的corha基因展示表达到酿酒酵母细胞表面,以达到高效催化的实用目的。与转入原始rha基因的重组酿酒酵母菌株相比,转入密码子优化corha基因的重组酿酒酵母菌株表面展示coRHA蛋白的表达量提高了2.9倍,培养60 h后coRHA的酶活力提高了2.7倍。以对硝基苯-α-L-鼠李糖苷(p NPR)为底物检测含corha基因重组菌株生产coRHA的酶活力,其最适p H及温度分别为5.0和45℃;以芦丁为底物,在p H 5.0、60℃条件下,coRHA水解芦丁合成异槲皮苷的得率为79.81%±3.1%。采用系统密码子优化策略,为利用工程菌工业化生产coRHA,用于催化桑树黄酮苷类化合物定向水解提供了可行的方法。

O.oeni糖苷酶活性对干白葡萄酒萜烯类香气的影响

由酒酒球菌(O.oeni)引发的苹果酸乳酸发酵(MLF)在降低葡萄酒酸度的同时,还伴随着多种糖苷酶的合成释放,该过程对源自葡萄中的键合态香气前体物质转化产生积极影响。以分离、鉴定的2株本土O.oeni菌株ZX-1、GF2为研究对象,以商业菌株VP41为对照,分析探讨单一发酵条件(初始pH值、乙醇体积分数、SO2添加量和发酵温度)及复合酿酒条件对供试菌株的β-D-葡萄糖苷酶及双糖苷酶活力累积量的影响,通过微酿试验分析供试菌株接种发酵后的霞多丽干白葡萄酒中萜烯类香气物质的变化。结果表明:随着乙醇体积分数及SO2添加量的增加,菌株的糖苷酶活力累积量均呈先上升、后下降的变化趋势;较高pH值条件更有利于O.oeni菌株糖苷酶的合成;β-D-葡萄糖苷酶和双糖苷酶活力累积量对发酵温度的响应存在差异。在复合酿酒条件下,本土O.oeni菌株的双糖苷酶活力累积量显著高于商业菌株VP41(P<0.05),而β-D-葡萄糖苷酶活力累积量则略低于VP41。SO2添加量对所有供试菌株的糖苷酶活性均有极显著影响(P<0.01),pH值、乙醇体积分数对菌株ZX-1、GF2和VP41的糖苷酶活性有显著影响(P<0.05),发酵温度仅对菌株ZX-1、VP41的β-D-葡萄糖苷酶和VP41的双糖苷酶活性有显著影响(P<0.05)。菌株的最佳产酶条件为:乙醇体积分数12%、SO2添加量30 mg/L、pH值3.6、发酵温度22℃,在此条件下,菌株GF2的双糖苷酶活力累积量最高(46.137 mU/mL),其次是ZX-1(45.932 mU/mL)和VP41(37.011 mU/mL)。微酿试验萜烯类化合物分析结果显示,本土O.oeni ZX-1发酵后的酒样中虽然萜烯类物质种类仅次于VP41处理后的酒样,但酒样中的总含量却较高,α-松油醇、香茅醇、大马士酮、芳樟醇等萜烯类物质的质量浓度高于阈值,有效提升了品种香气特征。

羊肝源穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶的分离及其动力学特性

对羊肝中含有的水解穿山龙薯蓣皂苷鼠李糖糖基的穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶进行了分离、纯化，并对其动力学特性进行了研究．结果表明，粗酶液经DEAE—Cellulose离子交换层析柱纯化后，其比活提高了19．9倍．在pH=6．8、反应温度为42℃、反应时间为8h和底物浓度为23mmol／L的条件下，该酶达到其最高活力．在10～200mmol／L范围内，Fe^2＋和Cu^2＋对酶活力有明显的抑制作用，Mg^2＋和Zn^2＋对酶活力有微弱的激活作用，而Ca^2＋对酶有较强的激活作用．采用SDS—PAGE方法测得酶蛋白分子量为71000．选择穿山龙薯蓣皂苷、人参皂苷Re和芦丁为酶反应底物，进行酶的底物专一性研究发现，穿山龙薯蓣皂苷-α-L-鼠李糖苷酶对其底物具有高度专一性．

酶法提取铁皮石斛多糖工艺优化及对挥发性成分的影响研究

铁皮石斛具有重要的药用价值,但其资源有限,因此对其充分开发和利用具有重要的意义。本文利用α-L-鼠李糖苷酶辅助提取铁皮石斛多糖,通过对酶解温度、酶解时间及加酶量三个因素进行优化,提高铁皮石斛多糖提取率;结果显示,在酶解温度为40℃、酶解时间为1 h、加酶量为2.5%时,多糖提取率为38.4%,而不加酶处理多糖提取率仅为21.7%,酶法处理大大增加了铁皮石斛的多糖提取率。同时,运用顶空固相微萃取技术结合气相色谱质谱联用仪(HS-SPME-GC-MS)分析比较α-L-鼠李糖苷酶对铁皮石斛挥发性成分的影响;GC-MS分析表明,铁皮石斛加酶处理前后共发现31种挥发性成分,主要成分均为己醛、1-辛烯-3-醇、异薄荷醇和3-辛烯-2-酮,并且醛类化合物在加酶处理前后的样品中相对含量均最高,且加酶处理后产生6种新的挥发性成分。该研究结果表明α-L-鼠李糖苷酶的使用可显著增加对铁皮石斛多糖提取率,并为铁皮石斛挥发性成分的研究和开发利用提供一定的参考依据。

多形拟杆菌α-L-鼠李糖苷酶序列分析与酶学性质

α-L-鼠李糖苷酶在生物技术领域具有很好的生物催化应用前景。目前,仅16个细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶基因被报道,对α-L-鼠李糖苷酶的序列特征与分子催化机制了解尚不完善。人体肠道细菌多形拟杆菌可利用多种多糖与糖苷,其基因组包括6个预测的α-L-鼠李糖苷酶基因,本文集中于连续定位于一个基因座的2个α-L-鼠李糖苷酶基因BtRha78D和BtRha78E,通过研究二者的序列特征和酶学特性旨在确定此基因座的生物学意义。序列分析显示,BtRha78D和BtRha78E的序列组成与长度差异性大,与已发现的α-L-鼠李糖苷酶序列一致性较低,分子进化关系也较远;酶学性质研究表明,BtRha78D和BtRha78E可高效水解底物p NPR,最适p H分别为p H6.0与p H 7.0。BtRha78E在p H 7.5~8.0范围内,仍能保持52%以上的活性。BtRha78D和BtRha78E最适温度为50℃,对pNPR的kcat分别为14.78 s-1和5.48 s-1,Km分别为0.14 mmol/L和0.44 mmol/L,kcat/Km分别为105 600 s-1L/mol和12 500 s-1L/mol。BtRha78D和BtRha78E耐受低浓度(1%)有机溶剂,10%浓度显著降低酶活性,对二甲亚砜具有很好的耐受性,10%浓度下仍能分别保持42%和53%的活性。本研究揭示,α-L-鼠李糖苷酶BtRha78D和BtRha78E间的序列组成与长度差异性很大,具有相同的催化活性而酶学性质却不同,一个包含2个α-L-鼠李糖苷酶基因的基因座可能参与多形拟杆菌降解利用含α-L-鼠李糖基的多糖与糖苷化合物。

柚苷酶的生产及其在食品工业中的研究进展

柚苷酶体系由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成,不同来源的柚苷酶性质不同,现在柑橘加工的主要产品柑橘汁的主要面临问题是蜜柚中的苦味物质,柚苷酶可以水解柚皮苷使果汁苦味减轻,是果汁脱苦的关键酶,但是目前国内关于柚苷酶方面的研究报道甚少,而且我国缺乏适合工业化生产的高产酶菌株,这就极大限制了应用,本文主要介绍柚苷酶的酶学性质、微生物生产方法以及在食品工业中的应用。

黑曲霉S-05产柚苷酶的纯化与分离

从黑曲霉S-05发酵液中提纯了柚苷酶并分离为α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶。经过(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-25脱盐、Cellulose DE-52、Sephadex G-100四步,得到电泳纯的α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE电泳测得α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶分子量分别为66 ku、102 ku。纯化后的α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶酶比活分别为859.21U/mg和947.37U/mg,酶活回收率分别为43.77%和33.33%。

黑曲霉菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶发酵的影响

α-L-鼠李糖苷酶是工业上一种重要的水解酶。为了方便地优化和监控α-L-鼠李糖苷酶的发酵生产过程,在5 L发酵罐水平研究黑曲霉菌丝体活力与α-L-鼠李糖苷酶产量之间的关系,菌丝体活力采用TTC-脱氢酶法进行测定。实验结果表明,在发酵过程中维持适宜的菌丝体活力对α-L-鼠李糖苷酶的产量非常重要:当摇瓶种子菌丝体活力达到最大值0.388 U/mL时,对应的5 L发酵罐中α-L-鼠李糖苷酶的产量最大;控制发酵过程的pH恒定于5.5,可以有效延缓菌丝体活力下降速度,使α-L-鼠李糖苷酶的产量提高28.7%;当搅拌转速低于400r/min或通气量低于0.3 vvm时,发酵24～36 h的菌丝体活力大幅下降,α-L-鼠李糖苷酶的产量显著降低。因此,可以将菌丝体活力作为α-L-鼠李糖苷酶发酵工艺优化和生产过程控制中一项重要的监控参数。

耐久肠球菌产α-L-鼠李糖苷酶的液体发酵培养基优化研究

通过单因素试验及正交试验确定最佳碳源、氮源和无机盐浓度。最佳培养基的基本组成为蔗糖1.25%,大豆蛋白胨1.25%,磷酸二氢钾2mmol/L,牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,氯化钠0.5%,硫酸铁3mmol/L。最佳培养条件为培养温度34℃,发酵时间4d,70mL培养基的接种量为3%。

黑曲霉S-05产柚苷酶液态发酵培养条件的优化

以黑曲霉(Aspergillus niger S-05)菌株作为实验材料,采用摇瓶发酵方法,以α-L-鼠李糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、柚苷酶三酶酶活为评价指标,对其液态发酵条件进行了研究。优化后的培养条件为:2.0%豆粉、0.5%蔗糖、0.05%柚苷、0.6%MgSO4·7H2O、0.2%吐温-80、培养温度26℃、pH5.0,250mL三角瓶装量30mL、转速190r/min。此时柚苷酶酶活达到429.09U/mL,比优化前的基础培养基(137.78U/mL)提高了2.1倍。

微生物来源柚苷酶的研究进展及应用

柚皮苷是影响柚子汁品味的最主要因素,柚苷酶具有将柚皮苷分解为普鲁宁、鼠李糖、葡萄糖和柚皮素等物质的功能,并且这些物质已广泛用于制药和饮料行业。本文介绍了近年来国内外微生物来源的柚苷酶的研究、酶学特性、酶活测定、结构与功能等,表明细菌来源的柚苷酶最适温度为37～70℃,最始pH值为4.5～8.0;真菌来源的柚苷酶最适温度为30～75℃,最始pH值为4.0～11.0。介绍了柚苷酶及其相关产物在食品、饮料和制药工业中的应用进展,发现柚苷酶不仅具有脱苦的作用,还对人类的身体健康具有重要作用。展望了今后的研究方向,应该从柚苷酶高产菌株的选育、发酵产酶的工艺优化和酶的应用等方面开展工作,大幅度提高柚苷酶的产酶水平。

桑树黄酮苷芦丁定向糖基改造的液滴微流控酶催化研究

设计新颖的生物催化体系对桑树黄酮苷的特定糖基进行定向改造,以制备高附加值的活性产物。利用微芯片制备油包水型液滴,考察分散相与连续相的压力对液滴生成频率及粒径的影响,并在载有α-L-鼠李糖苷酶的液滴中微流控催化芦丁的鼠李糖基水解反应。结果表明,以流动聚焦型芯片制备液滴相对稳定,当分散相和连续相压力分别为125×10^4Pa和15×10^4Pa时,液滴生成频率高达191 min^-1,最大粒径为15 mm,有效避免了液滴聚集。采用响应曲面法优化液滴微流控酶催化芦丁水解制备异槲皮苷的工艺条件,当温度为35℃、底物质量浓度为002 g/L、缓冲液pH值为55时,产物的时空产率高达(755±13)μg/(m3·d)。因此,液滴微反应器用于桑树黄酮苷的糖基定向改造具有良好的可行性。

乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒p SE-prha2和p SE-prha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60℃,Km值为(3.039±0.581)mmol/L,Vm a x值为(2.032±0.186)μmol/(min·mg);PRHA3的最适p H值和温度分别为5.5和45℃,Km值为(2.797±0.132)mmol/L,Vmax值为(113.35±1.485)μmol/(min·mg)。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,p NPR)以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷(4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,p NPA)有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。