神经生长锥内α-spectrin与F-actin的免疫细胞化学研究

目的 为了探讨α 血影蛋白 (α spectrin)和纤维型肌动蛋白 (F actin)在神经生长锥激烈运动与神经生长过程中的作用机制。方法 采用免疫双荧光染色法 ,以共聚焦激光扫描显微镜观察初代培养脊神经节细胞生长锥的连续水平断面上观察α spectrin和F actin的三维分布特点及其相互关系。结果 在水平面上 ,α spectrin和F actin分布在细胞质中 ,尤以细胞膜下、生长锥的P区伸展方向的前端和丝状伪足内分布最多 ,且α spectrin比F actin更接近细胞膜 ;在纵轴方向 ,α spectrin从基质侧到表面游离侧都有分布 ,而F actin在生长锥体部C区和表面游离侧分布较少。结论 提示α spec trin和F actin共同参与生长锥运动、神经生长外 ,还参与构筑生长锥内的三维网架及维持生长锥的极性。

β2-spectrin的siRNA对AML-12肝细胞增殖特性的影响

目的应用特异性siRNA干扰小鼠肝细胞株AML-12中β2-spectrin表达,检测AML-12细胞增殖凋亡以及细胞周期的改变。方法化学合成β2-spectrin特异性siRNA,分别转染AML-12细胞,荧光定量PCR和Western blot确定其抑制效果。AML-12细胞经TGF-β细胞因子处理4h后,转染β2-spectrin特异性siRNA,48h后,BrdU标记法以及流式细胞术检测β2-spectrin沉默前后AML-12细胞增殖、凋亡以及周期变化;共聚焦技术检测干扰β2-spectrin表达对TGF-β/Smad信号通路中Smad3、Smad4核定位的影响。结果 siRNA可以高效特异沉默β2-spectrin的表达。流式细胞术检测显示,β2-spectrin沉默促进AML-12细胞增殖,抑制凋亡,S期细胞比例显著升高。免疫荧光结果显示,TGF-β处理后,Smad3、Smad4表达定位于细胞核,沉默β2-spectrin干扰Smad3、Smad4细胞核内定位。结论沉默β2-spectrin的表达促进AML-12增殖,抑制凋亡,促进细胞向S期转化。其机制可能是通过干扰Smad3、Smad4核定位而抑制TGF-β/Smad信号通路,进而发挥诱导凋亡效应。

角膜穿通伤后视网膜钙蛋白酶、细胞骨架蛋白α-Ⅱ spectrin和NF200的分布及其相对含量

目的观察角膜穿通伤后钙蛋白酶(m-calpain)、血影蛋白(α-Ⅱspectrin)及神经丝蛋白-200(neurofilament protein-200,NF200)在视网膜中的分布特征,检测骨架蛋白降解产物相对含量的动态变化,初步探讨角膜穿通伤后视网膜继发性损伤的病理机制。方法清洁级成年雌性SD大鼠50只,随机分为正常对照组和角膜穿通伤后6h、24h、48h、72h组,每组各10只。于眼球颞侧角膜缘用无菌注射器刺穿角膜制作角膜穿通伤模型。各组5只大鼠制作眼球切片,用相应抗体免疫荧光染色,观察m-calpain、α-Ⅱspectrin和NF200在视网膜中的分布特征;同时用免疫印迹法检测各组另外5只大鼠眼球壁组织中上述蛋白相对含量的动态变化。结果正常对照组m-calpain主要分布于视网膜节细胞,组织中蛋白相对含量较低;角膜穿通伤组组织中阳性细胞数量增多,蛋白相对含量亦增高,于24h达高峰,各组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。正常对照组α-Ⅱspectrin和NF200主要分布于各种视细胞突起内,细胞界限和层次较清楚;角膜穿通伤组免疫荧光呈弥散分布,细胞界限和层次模糊不清;组织中α-Ⅱspectrin和NF200降解产物相对含量随m-calpain含量增高而增高,于24h达最大量,各组相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论角膜穿通伤可刺激视网膜细胞高表达m-calpain,后者对视网膜细胞骨架蛋白的降解是造成视网膜继发性损伤的重要因素。

β-G spectrin的显性基因突变破坏致密核心囊泡的分泌(英文)

β-spectrin是细胞膜骨架的重要组成蛋白,其主要分布于质膜的基底部位.在线虫中只有一个编码β-spectrin亚基(β-G)的基因即unc-70.除了稳定质膜,使细胞产生极性等功能外,有报道称它还参与细胞分泌的调节过程.研究发现,在线虫中β-G spectrin的显性基因突变体unc-70(n493)会导致DCVs的分泌缺陷.在活体下,unc-70(n493)突变虫系的神经多肽分泌显著下降.此外,在主要分泌致密核心囊泡的ALA神经元内,钙光解释放促发的快相分泌也比野生型减少.运用TIRFM成像技术,观察在unc-70缺失的情况下ALA神经元内DCVs的锚定过程,结果显示质膜附近囊泡的密度没有显著变化,但囊泡在细胞膜附近停留的时程变短,表明囊泡锚定受到阻碍.为了验证unc-70是否还同时参与调控突触囊泡的分泌过程,运用电生理记录活体线虫神经肌肉接头的方法,发现自发的突触后电流mEPSCs没有明显变化.上述试验结果表明,β-G spectrin的显性基因突变虫系能够影响致密核心囊泡的分泌过程,其机制可能是影响了囊泡的锚定过程.

遗传性球形红细胞增多症——一家系中SPTA1基因突变分析及产前诊断

对1遗传性球形红细胞增多症(HS)家系进行基因检测分析,为家系成员提供遗传咨询和产前诊断。收集家系成员的临床资料,提取家系成员外周血及羊水细胞DNA,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析红细胞膜蛋白缺陷情况,用高通量测序、PCR结合Sanger测序检测分析基因突变情况。Western blot结果显示:患儿及其父亲α-血影蛋白表达量减少。高通量测序、PCR结合Sanger测序发现患儿SPTA1基因中存在c.2179_2180delAG和c.3710A>G复合杂合突变,分别来自父亲和母亲,均为新突变,其中c.2179_2180delAG为致病突变的可能性大。PCR结合Sanger测序检测胎儿羊水细胞DNA未发现其携带上述突变,胎儿娩出后随访与产前诊断结果一致。本研究发现2个SPTA1基因新突变,扩展了SPTA1基因突变谱,对HS的基因诊断和遗传咨询有重要意义。