芍药苷对α-突触核蛋白降解通路的影响

目的:探讨芍药苷对α-突触核蛋白的降解途径-自噬和泛素-蛋白酶体通路的影响。方法:PC12细胞用或不用MPP+(0.5 mmol/L)处理24 h,然后用芍药苷(50μmol/L)或雷帕霉素(0.2μg/m L)处理24h,MTT法检测细胞增殖活性,Western印迹检测α-突触核蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3-Ⅱ)和E1的蛋白质表达水平,共聚焦显微镜观察α-突触核蛋白和LC3-Ⅱ在细胞内的荧光强度及共定位情况。结果:(1)与MPP+组相比,雷帕霉素和芍药苷处理后细胞过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活力均显著下降(P<0.001),细胞形态恢复正常;(2)MPP+处理导致LC3-Ⅱ和E1表达水平升高,雷帕霉素处理后LC3-Ⅱ增高而E1水平下降,芍药苷处理既显著上调LC3-Ⅱ(自噬)也上调了E1的表达(泛素-蛋白酶体途径)(P<0.001),促进了α-突触核蛋白的降解;(3)MPP+增强细胞内α-突触核蛋白和LC3-Ⅱ的荧光强度,芍药苷处理后α-突触核蛋白的荧光强度下降。结论:本研究结果表明芍药苷同时显著上调自噬和泛素蛋白酶体途径,促进了α-突触核蛋白的降解,减少细胞损伤。

蛋白磷酸酶2A活力增高减轻α-突触核蛋白引起的SK-N-SH细胞凋亡

目的观察蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)活力在α-突触核蛋白(α-Syn)引起的细胞凋亡中的作用。方法在SK-N-SH细胞中瞬时转染空载(myc)和α-Syn质粒,免疫荧光化学方法鉴定基因表达情况。Western blotting法和PP2A酶活力检测试剂盒检测PP2A磷酸化水平及酶活力。TUNEL染色和MTT法检测各组细胞死亡情况。结果过表达α-Syn可致磷酸化PP2A(pPP2Ac)水平显著增高及活力降低,同时导致细胞凋亡增多和细胞活力降低。PP2A激动剂C2-ceramide可显著逆转α-Syn所致细胞凋亡。结论 PP2A活力增高可减轻α-Syn过表达引起的细胞凋亡。

突触核蛋白基因rs356165多态位点与山西汉族人群帕金森病的关联分析

目的探讨SNCA基因rs356165多态性与山西地区散发性帕金森病(Parkinson′s disease,PD)的相关性,尤其是与发病年龄的相关性。方法采用病例-对照研究应用微测序技术对山西地区汉族人群rs356165多态性位点进行关联分析。结果检测了211例PD患者和256名在年龄、性别和种族相匹配的不相关的对照者。分析发现PD组和对照组rs356165等位基因、各基因型频率比较差异无统计学意义(P=0.553,P=0.452)。进一步将PD组按发病年龄分层后,与对照组相比,早发PD(early-onset PD,EOPD)或晚发PD(late-onset PD,LOPD)在基因型频率上比较差异无统计学意义(P=0.9,P=0.352)。结论 rs356165多态性与山西汉族人群中散发PD患者无相关性。

α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与RhoGTPases信号通路的活化相关

目的探讨α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡的分子机制。方法构建α-Syn寡聚体诱导SHSY5Y细胞凋亡模型,流式细胞技术检测SH-SY5Y细胞凋亡;免疫荧光检测SH-SY5Y细胞内α-Syn阳性包涵体;Pull down检测SH-SY5Y细胞Rac1、Cdc42、RhoA活性。结果与对照组相比,α-Syn寡聚体诱导SH-SY5Y细胞凋亡率显著增加,细胞内α-Syn阳性包涵体数量增加,Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。结论α-突触核蛋白诱导的人神经母细胞瘤细胞凋亡与Rho GTPases信号通路的活化相关。

小肽在原核和真核细胞中抑制α-synuclein异常折叠的研究

目的:研究在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠的小肽,在人神经母细胞瘤SH-SY5Y中的抑制作用。方法:基于a-Syn疏水区域设计的5种透膜小肽在大肠杆菌中能够有效抑制α-synuclein异常折叠;构建真核表达质粒CMV-SynGFP-IRES-Pn并转入SH-SY5Y细胞,通过测定细胞荧光强度分析小肽抑制α-synuclein异常折叠情况,由此评价大肠杆菌筛选系统确定的小肽在真核SH-SY5Y细胞中的有效性。结果:在大肠杆菌中能有效抑制α-Syn(129A)异常折叠的三种小肽R7P1、R7P3、R7P4,在SH-SY5Y中的作用效果也十分明显,分别比对照肽ASI1D提高了114%、98%和98%。对于α-Syn(53T),R7P1和R7P2在SH-SY5Y中分别比对照提高了90%和44%;然而在两种细胞中,5种透膜小肽对野生型α-Syn(WT)的作用与对照相比差距不明显。

α-Synuclein与MPP^+细胞毒性协同作用的研究

目的模拟与帕金森病发病密切相关的遗传因素与环境因素,研究α-synuclein与MPP+对细胞的毒性作用。方法RT-PCR方法扩增α-synuclein基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染;Western blot,MTT方法,双报告基因检测法和显微镜观察,研究过表达α-synuclein和MPP+对细胞存活率及NFκB信号通路的影响。结果MPP+和α-synuclein均能够显著抑制细胞存活率,二者共同作用时抑制作用更加明显;而且研究发现α-synuclein能够抑制由转录因子NFκB介导的基因表达,MPP+能够进一步增强其抑制作用。结论在遗传背景发生改变时,细胞对外界环境中的毒素更加敏感,提示帕金森病的发病存在某种遗传易患性。

siRNA干扰SIAH对细胞活性和α-synuclein泛素化降解通路的影响

目的:研究si RNA干扰SIAH基因对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞α-synuclein泛素化、降解通路的影响。方法:用荧光标记的si RNA-FAM转染SH-SY5Y细胞后,专业设计合成3条针对SIAH的si RNA,Western Blot检测蛋白水平SIAH表达的变化,筛选出其中最高效的1条si RNA,用CCK-8法检测该si RNASIAH干扰SH-SY5Y细胞活性;流式细胞技术检测该si RNA-SIAH干扰SH-SY5Y细胞凋亡的影响;Western Blot检测α-synuclein、LC3、E1、P53蛋白水平表达的变化;q RT-PCR检测SIAH、α-synuclein、LC3、E1 m RNA水平表达的变化;免疫共聚焦分别检测SIAH、α-synuclein、LC3共定位情况。结果:3条si RNA均成功转染SH-SY5Y细胞,流式细胞术检测si RNA转染SH-SY5Y细胞转染率89%,Western结果显示其中si RNA-2#使细胞中SIAH蛋白表达明显降低,选取该序列进行研究。CCK-8法结果显示该si RNA干扰SIAH后对SH-SY5Y细胞活增高,流式细胞技术检测结果显示该si RNA干扰SIAH可抑制SH-SY5Y细胞的凋亡,与空白对照组、阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过Western Blot检测si RNA-2#组的α-synuclein、LC3、P53蛋白水平,与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低,E1蛋白水平增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过q RT-PCR检测si RNA-2#组的SIAH、α-synuclein、LC3-Ⅱm RNA水平与空白对照组、阴性对照组比较均明显降低,而E1的m RNA水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:应用si RNA干扰SIAH基因,通过促进泛素-蛋白酶体系统作用减少SH-SY5Y中α-synuclein聚集,SIAH基因有可能成为帕金森病治疗中的一个新靶点。

不同Hoehn-Yahr分期α-突触蛋白基因RS3831458多态性与帕金森病的关系

目的 探讨不同Hoehn-Yahr（H-Y）分期α-突触蛋白基因RS3831458多态性与帕金森病（PD）的关系。方法 采用基因测序法检测95例PD患者（PD组）及95名健康对照者（正常对照组）的α-突触蛋白基因RS3831458多态性,分析其与PD病情严重程度的关系。结果 与正常对照组比较,PD组AG缺失型基因频率显著升高,AG未缺失型频率显著降低（均P〈0.05）。与H-Y〈3级亚组比较,H-Y≥3级亚组AG缺失型基因频率显著增高,AG未缺失型频率显著降低（均P〈0.05）。AG缺失型与PD病情严重程度呈正相关（χ^2=4.633,OR=2.456,95%CI：1.076~5.605,P〈0.05）,AG未缺失型与PD病情严重程度呈负相关（χ^2=4.633,OR=0.407,95%CI：0.178~0.929,P〈0.05）。结论 RS3831458 AG缺失型引起的框移突变可加重PD病情。

α-Synuclein蛋白过表达对小鼠纹状体的影响

帕金森病是世界第二大老年神经退行性疾病,致病机理极为复杂。α-synuclein(α-syn)是帕金森病主要病理特征的路易小体的主要组成成分,其突变基因α-syn A30P也与部分家族性帕金森相关。通过对过表达野生型人源α-syn WT及其突变体α-syn A30P蛋白的转基因小鼠的行为学检验、脑部纹状体中氧化应激水平以及儿茶酚胺异喹啉物质水平的检测,研究过表达α-syn蛋白对小鼠纹状体产生的影响。结果显示转基因小鼠模型与正常鼠相比,其协调能力明显下降,纹状体与全脑的比例显著降低。同时,模型鼠脑中的氧化应激水平与儿茶酚胺异喹啉物质的表达水平均显著升高。研究结果说明,α-syn蛋白及其突变体的过表达会引起小鼠脑部纹状体中氧化应激水平与儿茶酚异喹啉物质表达水平的升高,从而导致纹状体组织严重损伤。

姜黄素对α-突触核蛋白基因突变或过表达诱导的寡聚体形成及线粒体ATP敏感性钾离子通道的影响

目的探讨姜黄素对r突触核蛋白（a-synuclein）寡聚体形成、线粒体膜电位及线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP）的影响。方法构建野生型、A53T突变型{1-synuclein真核表达质粒，用脂质体介导转染方式将构建好的质粒转入PCI2细胞，并分别应用姜黄素（20ttmol／L）、5-羟基葵酸盐（5-hydroxydecanoate，5-HD）进行干预；48h后应用免疫印迹、斑点杂交检测细胞a-synuclein寡聚体形成；应用JC-1荧光探针及乳酸脱氢酶（1actatedehydrogenase，LDH）检测线粒体膜电位及细胞膜毒性损伤；并在姜黄素干预处理前15min给予5-HD预处理，免疫印迹检测mitoKATP蛋白的功能亚基Kir6．2的改变，细胞膜片钳观察mitoKATP的改变。结果将构建所得EGFP-α—synuclein—wT、EGFP—α—synuclein—A53T真核表达质粒转染PCI2细胞，48h后免疫印迹及斑点印迹结果显示，α—synuclein基因过表达或突变诱导均可促进α—synuclein寡聚体形成，姜黄素可明显减弱α-synuclein基因过表达或突变诱导的α—synuclein寡聚体形成；JC-1及LDH结果显示，与正常PCI2细胞相比，转染野生型、A53T突变型组细胞LDH水平分别升高35．5％及42．3％（P〈0．05），jc-1红／绿荧光比率与正常PCI2细胞相比下降60．44％、65．22％（P〈0．05），姜黄素干预后，LDH水平分别下降36．3％及23．5％（P〈0．05），红／绿荧光比率上升48．46％、50．33％（P〈0．05）；转染野生型或A53T突变型α—synuclein融合表达载体组Kir6-2蛋白表达增强，早期通道电流有明显增高的趋势，随后降低，应用姜黄素干预后，α—synuclein基因过表达或突变所诱导的Kir6．2蛋白表达下调，但细胞mitoKATP通道电流增加，与转染组比较有统计学意义（P〈0．05）。结论姜黄素可抑制α-synuclein基因过度表达或突变诱导的α—synuclein寡聚体形成；姜黄素可能通过稳定线粒体膜电位阻断了α—synuclein基因过表达或突变所导致的细胞凋亡；mitoKATP通道的开放可能是α—synuclein基因过表达或A53T突变诱导细胞凋亡的自发始动保护机制，姜黄素可能通过开放mitoKATP通道拮抗α—synuclein基因过表达或突变所导致的细胞毒性，mitoKATP通道的开放程度与Kir6.2蛋白的表达不成正相关。

PINK1与α-synuclein相互作用结构域鉴定

目的:确定PINK1与α-synuclein相互作用的结构域。方法:将PINK1不同结构域质粒(pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1WT,pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(G309D),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔN35),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(ΔC145),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(156～509),pcDNA3.1-3xFlag-hPINK1(Δ156～581),pcDNA3.1-3xFlag-vector)分别和pCMV-Myc-α-synuclein质粒共转染人胚肾HEK293T细胞,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术验证PINK1与α-synuclein相互作用的结构域;同时进行免疫细胞化学染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白的共定位关系。结果:Co-IP实验结果表明PINK1与α-synuclein相互作用的结构域为PINK1的激酶结构域。免疫细胞化学实验也证实α-synuclein只与含激酶结构域的PINK1蛋白在细胞中存在共定位关系。结论:PINK1与α-synuclein相互作用的结构域位于其激酶结构域。

α-突触核蛋白A53T基因多态性与帕金森病相关性研究

目的分析中国人群α-突触蛋白A53T基因多态性与帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）的相关性。方法采用常规聚合酶链式反应测定224例散发性PD患者（PD组）、154例健康体检人员（对照组）的α-突触蛋白A53T基因多态性。PD患者根据Hoehn—Yahr分级（H—Y分级）标准分为H-Y≥3组（n=172）与H．Y≤2．5组（n=52）。使用SPSS19．0软件对各组基因型和等位基因频率以及A53T基因的表达与PD病情严重程度的相关性进行χ2检验分析。结果PD组与对照组A53T基因型A／A频率分别为40（17．9％）、10（6．5％）（χ2=10．267，P=0．001，OR=3．13，95％CI=1．514～6．473）；等位基因A频率分别为160（35．7％）、70（22．7％）（χ2=14．543，P=0．000，OR=1．889，95％CI：1．359-2．625）。H-Y≥3组A53T基因型A／A频率为30（17．4％），H—Y≤2．5组A53T基因型A／A频率10（19．2％），与对照组比较，均差异有统计学意义（P=0．003，0．007）；H—Y≥3组等位基因A频率为122（35．5％），H—Y≤2．5组等位基因A频率为38（36．5％），与健康对照组比较，均差异有统计学意义（P=0．000，0．006）。H—Y≥3组与H—Y≤2．5组A53T基因型A／A、等位基因A频率比较，均差异无统计学意义（P=0．768，0．841）。结论中国人群中A53T基因多态性为帕金森病发病的易感因素，但其与散发性PD病情严重程度无明显相关。