凝血酶产品中的α-2巨球蛋白活性研究

凝血酶作为一种快速止血药,主要从血液中提取,而血液中的血浆蛋白有100多种,因此国内生产的凝血酶不可避免地含有多种血浆杂质蛋白。α-2巨球蛋白(α-2M)是一种重要的血浆蛋白之一。由于巨球蛋白保护胰蛋白酶,用大豆胰蛋白酶抑制剂灭活未被保护的胰蛋白酶后,利用Na-benzoy-DL-arginine-pnitroanilide(BAPNA)作为底物检测凝血酶中巨球蛋白的活性的方法,证明了从血浆中提取的凝血酶易存在α-2巨球蛋白,从而为凝血酶进一步纯化提供了研究方向。

肺癌患者血栓前状态的研究

对１０４例肺癌的血小板表面α－颗粒膜蛋白、血浆血管性假血友病因子、凝血酶原、凝血酶、抗凝血酶Ⅲ进行了测定。结果分别有６６．４％、８１．７％、６２．５％的患者α－颗粒膜蛋白分子数、血管性假血友病因子及凝血酶浓度较正常升高，早晚期差异显著（Ｐ＜０．０５）。９．６％患者抗凝血酶Ⅲ含量和活性减低。追踪观察１．５年发现，有无血栓前状态其转移率和死亡率有显著差异（Ｐ＜０．０５）。由此可见肺癌常伴血栓前状态，其程度与病期及预后密切相关。

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法 ,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因 ,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式 ,得到了胸腺素前体肽段 31肽和N 端未经乙酰化修饰的 2 8肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的 35 %～ 40 % ,样品肽的产量也达到了约 2 0 0mg L(肽 发酵液 )的产量。经质谱测定 ,分子量分别为 336 6和 30 6 6。BalB C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明 ,所构建的GST Tα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用 ,其中N 端未经乙酰化的 2 8肽产物与 31肽产物活性相近 。

JAK2-STAT3途径介导凝血酶诱导的小胶质细胞TNF-α的激活

目的 探讨Janus激酶2/信号转导和转录激活子3（JAK2/STAT3）途径可否介导凝血酶诱导的小胶质细胞肿瘤坏死因子（TNF-α）激活。方法 采用20U/mL凝血酶或AG490预处理（10μmol/L）＋凝血酶（20U/mL）处理原代培养的小胶质细胞,经Western Blot法检测细胞Janus激酶1（JAK1）、磷酸化（P）-JAK1、P-JAK2、磷酸化-信号转导和转录激活子3（P-STAT3）、STAT3表达,酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清上清液TNF-α水平。结果 经凝血酶处理2-12h后JAK2、STAT3发生了磷酸化,3-48h后TNF-α表达增加。经JAK激酶抑制剂AG490预处理后再经凝血酶处理的小胶质细胞的JAK2和STAT3激活显著减少,且TNF-α释放被抑制。结论 JAK2-STAT3途径可介导凝血酶诱导的小胶质细胞TNF-α激活。

TNF-α对凝血酶引起的肥大细胞蛋白酶激活受体表达的影响

目的:探讨TNF-α对凝血酶引起的P815肥大细胞上蛋白酶激活受体表达的影响。方法:用或不用TNF-α预处理肥大细胞后,以不同浓度凝血酶激发P815肥大细胞,用流式细胞术检测肥大细胞上PAR-1,2,3,4表达的变化情况。结果:TNF-α不影响凝血酶作用肥大细胞P815后PAR-1表达;TNF-α预处理后凝血酶作用肥大细胞P815后,PAR-2,3,4表达较基础培养液对照组和非TNF-α处理组增强。结论:促炎因子TNF-α能够调节凝血酶引起的肥大细胞PAR表达进而参与肥大细胞相关的炎症反应。

凝血酶预处理减轻凝血酶所致的脑水肿

目的:探讨凝血酶预处理对脑水肿的影响,检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在脑组织内的表达并分析其与凝血酶所致脑水肿的关系。方法:建立大脑皮质内血肿模型。选择健康成年SD大鼠40只,随机分为作为对照的未预处理组(ST组)和小剂量凝血酶(1U)预处理组(TT组)。观察不同时相脑组织含水量及钠含量的变化及TNF-α在脑组织内的表达。结果:ST组脑组织含水量和钠含量明显高于TT组,且第1天高于第3天。TT组与ST组脑组织内TNF-α阳性表达与含水量的变化相一致。结论:凝血酶预处理可以减轻凝血酶所致的脑水肿;TNF-α的表达与凝血酶所致的脑水肿有关。

水蛭渗滤液对猴RF/6A细胞表达TNF-α的影响

目的观察水蛭渗滤液对凝血酶诱导下猴脉络膜-视网膜(内皮)细胞(RF/6A)表达促血管生成因子TNF-α的影响。方法采用消化培养法,对猴RF/6A细胞进行体外传代培养,选择20μ/ml的凝血酶作为诱导浓度,分别作用于RF/6A细胞2、4、6、8、10、12及24 h,用ELISA法观察凝血酶对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的诱导情况。观察在有或无凝血酶诱导下水蛭渗滤液(64 mg/ml)对视网膜血管内皮细胞表达TNF-α的影响。结果 (1)凝血酶作用2 h,TNF-α的表达开始增加,作用4 h,TNF-α的表达达到最大,持续至10 h;4、6、8 h与空白组比较差异均有统计学意义(P<0.05);当凝血酶作用时间达12 h,TNF-α的表达开始下降,凝血酶组与空白组12 h和24 h比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)水蛭渗滤液对有或无凝血酶诱导组都能下调TNF-α的表达(P<0.05)。结论水蛭渗滤液能下调凝血酶诱导下猴RF/6A细胞表达TNF-α。

基于反向分子对接技术的异鼠李素靶标的预测

目的:利用反向分子对接技术对异鼠李素的潜在靶标进行预测。方法:采用id Target软件对蛋白质数据库中异鼠李素的潜在靶标进行筛选,利用Py Rx 0.8软件中的autodock vina模块对筛选的结果进行分子对接验证。结果:异鼠李素与硫氧还蛋白还原酶1、凝血酶、二氢叶酸还原酶、核受体ROR-α等4种靶蛋白的结合较好,其结合能(ΔGpred)分别为-11.7、-10.34、-10.11、-10.07kcal/mol;分子对接验证结果显示,异鼠李素与4种靶蛋白核心氨基酸具有静电作用力、氢键、范德华力等相互作用。结论:硫氧还蛋白还原酶1、凝血酶、二氢叶酸还原酶、核受体ROR-α可能是异鼠李素的潜在靶标。

血必净注射液对脓毒症大鼠血凝指标变化的影响

目的探讨血必净注射液对于脓毒症大鼠血凝指标变化的影响。方法将220只Wistar雄鼠采用随机数表法分为正常组(A组)、对照组(B组)、模型组(C组)、血必净干预组(D组)各55只,根据术后6 h、12 h、24 h、48 h及72 h时间点将各组大鼠均分为5个亚组;在C组及D组中建立脓毒症大鼠模型,D组术后采用血必净注射液于尾静脉给药;观察各组大鼠存活情况,并于各时间点测定血清血小板α颗粒膜蛋白(GMP-140)、凝血酶-抗凝血酶原复合物(TAT)及纤溶酶-α2-抗纤溶酶原复合物(PAP)水平及血小板数量。结果 A、B组内各时间点均无自然死亡大鼠,C、D两组术后6、12、24 h组均无自然死亡大鼠;术后48 h及72 h,C组的存活数量分别为4只、3只,D组存活数量分别为6只、4只。在各个时间点,4组的GMP-140水平、TAT浓度、PAP浓度及血小板数目比较,差异均有统计学意义(P<0.05);其中,相对于C组,D组的各个时间点的GMP-140水平较低、血小板数目较高(P<0.05),D组术后6 h、24 h、48 h及72 h的PAP浓度较低(P<0.05),D组术后24 h、48 h及72 h的TAT浓度较低(P<0.05)。C组及D组的GMP-140水平、TAT浓度、PAP浓度均随观察时间延长而升高,血小板数目水平均随观察时间延长而降低(P<0.05)。结论应用血必净注射液对脓毒症大鼠血凝指标有影响,可改善其凝血功能紊乱。

uPAR mRNA测定及其在U937细胞中的表达

目的研究凝血酶、TNF－α.IFN-γ等对U937细胞表达uPARmRNA的影响，观察凝血系统、炎症介质与纤溶功能变化间的关系。方法建立并应用逆转录PCR（RT－PCR）法测定培养U937细胞的uPARmRNA。结果1．经测定批间变异系数（CV间）确认了RT－PCR法测定uPARmRNA的稳定性；2以不同浓度凝血酶刺激24h，对U937细胞表达uPARmRNA有抑制和促进两种不同的效应：TNF－α、IFN－γ、ATRA和As2O3都能促进uPARmRNA表达，但剂量-效应关系并不相同。结论与凝血和炎症反应相关的因子及某些药物以不同方式和程度影响细胞表达uPARmRNA，说明它们的作用机制和意义并不相同。

关节手术病人血浆凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-α_2抗纤溶酶复合物的研究

目的探讨髋、膝关节手术病人血栓前状态和血液中凝血-纤溶系统的变化。方法每组病人术前及术后1、4、7、10天检测TAT、PAP、血凝常规等指标;术前及术后第7天￣10天应用彩色多普勒超声仪监测DVT。结果①手术组共有18例(40.9%)术后并发DVT,保守组共有9例(22.0%)并发DVT,对照组无DVT发生;②手术组术后并发DVT者术前及术后TAT均显著升高,而PAP水平较低;③术后并发DVT者与术前PAP/FB比值相关。结论①术前TAT检测可作为术后是否并发DVT的一项较有意义的预测指标。②术前较低的纤溶水平可能成为髋、膝关节置换术后DVT发病率高的原因之一。③术前血浆PAP/FB比值有望成为预测术后DVT的有用指标。

淋巴瘤、多发性骨髓瘤患者血栓前状态的观察

目的：探讨淋巴瘤、多发性骨髓瘤患者有无血栓前状态，判断病情，以其指导治疗。方法：采用放射免疫法、发色底物法等对４０例淋巴瘤、２４例多发性骨髓瘤的血小板表面α－颗粒膜蛋白、凝血酶原、凝血酶、血管性假血友病因子及抗凝血酶Ⅲ进行了测定。结果：前三项指标淋巴瘤组分别为４２．５％、３０％和４５％，多发性骨髓瘤组分别为６２．５％、２０．５％和５８．３％患者较正常升高。少数晚期淋巴瘤抗凝血酶Ⅲ含量下降。晚期淋巴瘤较早期易发生血栓前状态。结论：淋巴浆细胞系统恶性肿瘤常伴血栓前状态。

妊娠期高血压患者凝血功能、炎性因子及血脂水平变化及临床意义

目的探讨妊娠期高血压患者凝血功能、炎性因子及血脂水平变化及临床意义。方法选择2017年12月—2019年6月收治的妊娠期高血压87例作为研究组,选择同期正常产检的孕妇90例作为对照组。检测2组凝血功能指标[凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(Fib)、活化凝血酶原时间(APTT)]、炎性因子[白介素-2(IL-2)、IL-10和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]、血脂[高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总胆固醇(TC)]水平。结果研究组PT、TT、APTT、IL-10、HDL-C低于对照组,Fib、IL-2、TNF-α、TG、LDL-C、TC高于对照组(P<0.01)。结论妊娠期高血压患者体内存在着较明显的凝血功能、炎性因子和血脂水平的异常,对其在妊娠期高血压发病中的具体作用机制研究有利于该病的早期干预。

凝血酶激活小胶质细胞的时间及浓度依赖性研究

目的:用不同浓度的凝血酶在设定时间内刺激小胶质细胞,确定凝血酶激活小胶质细胞的最佳浓度。再以最佳浓度分别作用不同时间,以探讨该浓度凝血酶作用小胶质细胞激活的最佳时间。方法:体外培养小胶质细胞N9,分为正常对照组、凝血酶5U/mL组、10U/mL组、15U/mL组、20U/mL组、25U/mL组、30U/mL组,作用时间为6h,用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量、Griess法检测一氧化氮(NO)含量,以确定凝血酶激活小胶质细胞的最佳浓度。然后以最佳浓度分别作用于小胶质细胞3、6、12、24h,再次用上述方法检测细胞上清液中TNF-α、NO含量,确定凝血酶激活小胶质细胞的最佳时间。结果:凝血酶浓度为5U/mL时,TNF-α含量与正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.632),凝血酶浓度在10-20U/mL时,TNF-α含量随凝血酶剂量增加而逐渐升高,20U/mL时TNF-α的含量达到最高(P<O.001)。不同浓度凝血酶刺激组,细胞上清液中NO含量比较,组间差异有统计学意义(f=365.819,P<0.001)。凝血酶浓度为5U/mL时,NO的含量为4.44(±0.12)μmol,与正常对照组比较差异有统计学意义(P=0.018),且NO含量随着凝血酶浓度增加而升高,各组与正常对照组比较差异均有显著意义(P<0.001)。结论:凝血酶诱导小胶质细胞激活的最佳浓度为20U/mL,最佳时间为12h。

Sysmex HISCL-800全自动化学发光免疫分析仪检测血栓分子标志物的性能评价与分析

目的应用CLSI评价方案对Sysmex HISCL-800全自动化学发光免疫分析仪检测血栓分子标志物项目进行性能验证。方法根据CLSI系列文件(EP15-A、EP6-A),对Sysmex HISCL-800全自动化学发光免疫分析仪检测系统的血栓分子标志物项目的精密度、线性、参考区间、正确度进行评价与分析,结果与厂商声明的性能进行比较。结果血栓分子标志物4个检测项的实验室内变异系数结果均小于厂家声明的批内变异系数(CV<10%)。且该4项的线性回归方程的斜率均在1.00±0.05范围内,相关系数均R^(2)≥0.99。它们的参考区间验证结果均有95%以上检测值在参考范围内。该4项正确度均通过验证。结论Sysmex HISCL-800全自动化学发光免疫分析仪检测血栓分子标志物项目的实验结果与厂商声明的性能基本符合质量目标要求。

益肾活血汤辅助治疗对维持性血液透析患者炎性因子、高凝状态及血管内皮功能的影响

目的 探讨益肾活血汤辅助治疗对维持性血液透析患者炎性因子、高凝状态及血管内皮功能的影响。方法 选取2019年6月—2022年12月收治的慢性肾衰竭尿毒症200例,根据治疗方式不同将其分为观察组(采用益肾活血汤辅助维持性血液透析治疗,102例)和对照组(采用维持性血液透析治疗,98例)2组。比较2组治疗后临床效果,治疗前后炎性因子、凝血功能和血管内皮功能,以及治疗期间不良反应。结果 治疗后,观察组总有效率(93/102,91.18%)高于对照组(68/98,69.39%)(P<0.01)。治疗后,2组C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间及内皮素-1均较治疗前降低,且观察组低于对照组;硫化血红蛋白、一氧化氮均较治疗前升高,且观察组高于对照组(P<0.01)。治疗期间,2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 采用益肾活血汤辅助治疗维持性血液透析患者能改善炎性因子水平、机体高凝状态及血管内皮功能,且安全性较高。

重组人凝血因子Ⅷ对α-凝血酶生成活性的影响

A型血友病是最常见的遗传性出血疾病,其共同的特征是活性凝血酶生成障碍,凝血时间延长,临床上主要表现为凝血因子Ⅷ(FⅧ)质或量的异常,以关节、肌肉、内脏和深部组织自发性或轻微外伤后出血难以停止为特征,常在儿童期起病,反复关节出血可导致患者逐渐出现关节活动障碍而致残。男性人群中,A型血友病的发病率约为1/5000,而女性血友病患者极其罕见。我国血友病的患病率为2.73/100000人口,其中A型血友病占80%~85%。实验旨在探究重组人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)对下游凝血途经的激活能力,并与已上市同类产品进行比较。以缺凝血因子Ⅷ血浆为实验组样本,标准血浆为对照组,利用缓冲液将各个产品稀释至1、5和10 IU/mL,得到3个FⅧ活性工作液,所制备FⅧ工作液再用缺凝血因子Ⅷ血浆(模拟血友病甲样本)稀释10倍,制成0、0.1、0.5、1 IU/mL 4种不同活性FⅧ血浆样本,利用凝血酶生成分析仪分别检测rhFⅧ、Advate和血源FⅧ在不同浓度条件下,对α-凝血酶生成速度及生成潜力的影响。与Advate、血源FⅧ相比,rhFⅧ具有相同的促α-凝血酶生成效果;且α-凝血酶生成的峰高随FⅧ浓度的增加而呈上升趋势;达峰时间随FⅧ浓度的增加而呈下降趋势;α-凝血酶生成曲线下积分面积随FⅧ浓度增加而增加。rhFⅧ与市售重组及血源性FⅧ产品相比,在体外具有相同的促α-凝血酶生成活性,具备良好的成药性,未来有望在国内获批上市。

糖尿病肾病患者血栓相关因子动态评估对血栓风险的预测价值

目的探讨血栓相关因子动态评估对糖尿病肾病(DN)患者血栓风险的预测价值。方法回顾性选取2020年1月至2022年9月于沧州中西医结合医院进行治疗的98例DN患者为研究对象,治疗后进行随访,以患者出现深静脉血栓为观察终点,最终96例获得随访,根据有无血栓形成分为血栓组(n=21)和非血栓组(n=75)。收集患者的临床资料,通过单因素和多因素logistic分析DN患者血栓风险的影响因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血栓相关因子[凝血酶—抗凝血酶复合物(TAT)、纤溶酶-α-2-纤溶酶抑制剂复合物(PIC)、组织型纤溶酶原激活物/纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物(t-PAIC)和可溶性血栓调节蛋白(sTM)]对DN患者血栓风险的预测价值。结果两组患者一般资料、糖尿病病程、糖代谢、脂代谢和肾功能指标比较差异无统计学意义(P>0.05);两组患者的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)及D-二聚体(D-D)比较,差异有统计学意义(P<0.05);血栓组患者TAT、PIC、t-PAIC、sTM治疗前和后的水平,治疗前后水平的差值,治疗前后的变异系数,均高于非血栓组患者(P<0.01)。多因素logistic回归分析结果显示,TAT、PIC、t-PAIC、sTM的变异系数增高(OR=3.367,P=0.010;OR=19.106,P=0.042;OR=4.313,P=0.005;OR=9.389,P=0.003)为影响DN患者血栓风险的独立危险因素。ROC曲线结果显示,TAT、PIC、t-PAIC和sTM的变异系数预测DN患者血栓风险的AUC分别为0.818、0.806、0.873和0.825。结论血栓相关因子水平增高是DN患者血栓风险的独立危险因素,TAT、sTM、PIC和t-PAIC可作为预测其血栓风险的重要指标。

急性脑梗死超早期血浆TM、TAFI、IL-6、TNF-α水平与梗死体积的关系及诊断价值

目的:探讨急性脑梗死超早期血浆血栓调节蛋白(TM)、凝血酶激活纤溶抑制物(TAFI)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平与患者梗死体积的关系及对梗死体积的诊断价值。方法:将2018年6月-2019年9月期间于西安医学院第二附属医院就诊的75例急性脑梗死超早期患者纳入观察组,并把75例同期陈旧性脑梗死患者纳入对照组。检测观察组治疗前(且发病6 h内)、治疗3 d后及治疗7 d后以及对照组入院时血浆TM、TAFI、IL-6及TNF-α水平。比较观察组与对照组治疗前上述指标的差异。将观察组按照梗死体积分为小体积梗死组(27例)、中体积梗死组(30例)及大体积梗死组(18例),比较治疗前、治疗3 d及治疗7 d后三组上述指标的变化趋势及组间差异。采用有序Logistics回归分析治疗前上述指标与脑梗死体积的相关性;进行ROC分析治疗前上述指标对大体积梗死的诊断价值。结果:观察组治疗前(且发病6 h内)血浆TM、TAFI、IL-6及TNF-α水平均高于对照组(P<0.05)。随着病程的进展,治疗3 d后小体积梗死组、中体积梗死组及大体积梗死组上述指标均较治疗前降低(P<0.05),治疗7 d后则较治疗3 d后进一步降低(P<0.05);但各时间段大体积梗死组上述指标均高于中体积梗死组(P<0.05),而中体积梗死组的上述指标也均高于小体积梗死组(P<0.05)。有序Logistics回归分析提示治疗前上述指标水平对脑梗死体积可产生显著的正向影响。由ROC分析可见,治疗前上述指标均可用于诊断大体积梗死,且联合检测的诊断价值更优。结论:急性脑梗死患者血浆TM、TAFI、IL-6及TNF-α水平升高,但随病程的延长而下降,在急性脑梗死的发展中具有重要意义;在急性脑梗死超早期,患者的上述指标可能用于辅助诊断梗死体积。

乌司他丁干预对脓毒症幼鼠血清肿瘤坏死因子-α、P-选择素和凝血酶抗凝血酶复合物水平的影响

目的探讨使用乌司他丁(UTI)作为早期干预药物对脓毒症幼鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、P-选择素、凝血酶抗凝血酶复合物(TAT)水平的影响及意义。方法将120只4周龄雄性大鼠随机分为正常对照组、假手术组、脓毒症组、低剂量UTI干预组(50 000 U/kg)和高剂量UTI干预组(200 000 U/kg),每组24只。采用改良的盲肠结扎穿孔法制作脓毒症大鼠模型,低剂量和高剂量UTI干预组在建模后分别尾静脉注射UTI。ELISA法测定6、12、24 h时各组大鼠血清TNF-α、P-选择素、TAT水平。结果脓毒症组大鼠血清TNF-α、TAT、P-选择素水平在6 h时即出现显著升高,血清TNF-α、TAT水平至24 h时仍呈持续升高状态(P<0.05);P-选择素在12 h时达到峰值,24 h时出现回落(P<0.05)。UTI干预组中,P-选择素和TAT水平变化趋势和脓毒症组相同,TNF-α水平在6 h出现明显的增高,但随时间延长逐渐降低,且变化幅度均显著小于脓毒症组(P<0.05);高剂量组变化幅度显著小于低剂量组(P<0.05)。结论 UTI早期干预对脓毒症幼鼠模型的凝血功能有明显的改善,能抑制TNF-α、P-选择素、TAT的生成,且高剂量组较低剂量组作用更显著。