金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制研究

目的探究金黄色葡萄球菌α-toxin(Hla)促进皮肤组织中IL-19表达上调的作用机制。方法采用WT S.Aureus、△Hla S.aureus(Hla缺失菌株)以及PBS感染Balb/c小鼠背部皮肤,收集感染后第1、3、7天的皮肤组织,HE染色检测组织炎性病理损伤,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19、IL-1β的m RNA和蛋白水平的表达。分离小鼠骨髓的中性粒细胞,分别用WT S.Aureus、△Hla S.aureus以及meida(不含菌液的培养基)刺激6 h后,q RT-PCR、ELISA和Western blot检测IL-1β的表达。不同浓度IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12后,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-19的表达。结果△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,其皮肤损伤的面积减小,炎性细胞浸润和脓肿形成减少。同时q RT-PCR和ELISA检测发现,△Hla S.aureus组与WT S.aureus组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。体外中性粒细胞刺激发现,△Hla S.aureus组与WTS.aureus组相比,IL-1β蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。体外IL-1β刺激角质形成细胞PAM 2-12发现,与不刺激组相比,IL-19的m RNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。结论金黄色葡萄球菌分泌的α-toxin能够作用于中性粒细胞,促进了IL-1β的表达,IL-1β的过表达作用于皮肤的角质形成细胞,从而促进了IL-19的上调,可能参与了银屑病的发生与发展。

α-toxin调控miR-142表达抑制巨噬细胞吞噬功能的机制研究

目的探讨金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)分泌的α-外毒素(Hla)调控miR-142表达并抑制巨噬细胞吞噬功能的分子机制。方法采用野生型金葡菌菌株(WT S.aureus)、Hla缺失金葡菌菌株(△HlaS.aureus)及磷酸盐缓冲液(PBS)感染BALB/C小鼠背部皮肤、RAW264.7鼠源巨噬细胞,检测感染后皮肤组织和巨噬细胞miR-142表达水平。构建荧光素酶报告基因载体,采用荧光素酶活性实验分析miR-142对蛋白激酶Cα(PKCα)表达水平的调控作用。在RAW264.7细胞中过表达miR-142模拟物,分析细胞吞噬能力。结果与PBS处理组相比,△HlaS.aureus与WT S.aureus处理组皮肤组织和巨噬细胞miR-142表达水平下降(P<0.05)。MiR-142模拟物可抑制荧光素酶活性,抑制巨噬细胞RAW264.7细胞的吞噬能力(P<0.05)。结论金葡菌分泌的H1a促进巨噬细胞表达miR-142,进而通过下调PKCα表达水平抑制巨噬细胞的吞噬功能。

产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。

重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫效力评价

为探究重组产气荚膜梭菌α毒素对家兔的安全性和免疫保护效力,本研究构建了含产气荚膜梭菌α毒素基因的重组质粒pVL1393-CPA,并通过BD BaculoGoldTM转染试剂盒转染Sf9细胞后,经噬斑纯化获得单克隆重组病毒,将其感染High 5细胞进行表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE和western blot检测,结果显示均获得了45 ku的目的蛋白,即为重组α毒素。将重组α毒素用0.1%甲醛溶液灭活脱毒后与ISA 206 VG佐剂乳化制备亚单位疫苗(抗原含量为20μg/mL),以40μg/只肌肉注射体质量1.5 kg~2.0 kg的家兔,同时设PBS对照组,注射后连续观察7 d,结果显示实验兔临床观察无异常,该疫苗对家兔的安全性良好。随后以20μg/只肌肉注射家兔,免疫21 d后以相同剂量加强免疫一次,同时设佐剂对照组和α毒素对照组,首免21 d、二免14 d时采血分离血清,采用ELISA方法检测免疫兔血清IgG抗体效价,同时进行二免血清小鼠体内毒素中和试验以及家兔攻毒免疫保护试验,以评价该疫苗对家兔的免疫保护效力。结果显示,疫苗免疫组家兔血清IgG抗体效价比佐剂对照组和毒素对照组均极显著增高(P<0.001),二免血清对A型产气荚膜梭菌毒素小鼠体内的中和效价为32,疫苗免疫组家兔攻毒后均健活,攻毒保护率达100%,佐剂对照组和毒素对照组家兔攻毒后死亡率则为100%。上述结果表明制备的重组产气荚膜梭菌α毒素疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫保护效力,本研究为开发其他各型梭菌亚单位疫苗提供了重要借鉴。

点阵CO_(2)激光联合A型肉毒毒素治疗HS的临床疗效及对患者血清TNF-α、TGF-β_(1)和MMP-9水平的影响

目的:观察点阵CO_(2)激光联合A型肉毒毒素(Botulinum toxin A,BTXA)治疗增生性瘢痕(Hypertrophics cars,HS)的临床疗效及其对患者血清肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、转化生长因子β_(1)蛋白(Transforming growth factor-β_(1)protein,TGF-β_(1))和基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP-9)水平的影响。方法:选取2019年2月-2020年3月本院收治的HS患者50例,按照随机数表法将其分为对照组和观察组,各25例。对照组接受点阵CO_(2)激光治疗,观察组接受点阵CO_(2)激光联合BTXA治疗。观察两组患者治疗前后温哥华瘢痕量表(Vancouver scar scale,VSS)评分、视觉模拟评分(Visual analogue scale,VAS)、数字评分法(Numeric rating scales,NRS)、瘢痕面积、瘢痕厚度以及血清TNF-α、TGF-β_(1)、MMP-9水平变化,并记录不良反应发生情况,比较不良反应总发生率。结果:治疗前,两组患者VSS评分、VAS评分、NRS评分、瘢痕面积及瘢痕厚度无明显差异(P>0.05);治疗后6个月,两组患者VSS评分、VAS评分、NRS评分、瘢痕面积及瘢痕厚度显著降低(P<0.05),且观察组显著低于对照组(P<0.05);治疗前两组患者血清TNF-α、TGF-β_(1)、MMP-9水平无明显差异(P>0.05);治疗后1个月,两组患者血清TNF-α、TGF-β_(1)、MMP-9水平均显著降低(P<0.05),且观察组显著低于对照组(P<0.05);两组患者不良反应总发生率无明显差异(P>0.05)。结论:点阵CO_(2)激光联合BTXA治疗HS疗效显著,能够明显降低VSS评分,减轻患者的痛苦及瘙痒程度,降低患者血清TNF-α、TGF-β_(1)和MMP-9水平,安全性高。

儿童难治性肺炎支原体肺炎血清和肺泡灌洗液中CARDS TX、TNF-α、SAA的表达水平及意义

目的 探究难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)患儿血清和肺泡灌洗液中社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(CARDS TX)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血清淀粉样蛋白A(SAA)的表达水平和临床意义。方法 选择2021年2月至2023年2月郑州大学第一附属医院收治的接受支气管镜检的132例MPP患儿作为研究对象,其中47例RMPP患儿作为Ⅰ组,另外85例MPP患儿作为Ⅱ组,同期在医院门诊体检的80例健康儿童作为Ⅲ组。对比3组血清及Ⅰ组、Ⅱ组肺泡灌洗液的CARDS TX、TNF-α、SAA水平,绘制受试者工作特征(ROC)曲线评估其预测RMPP的效能。结果 Ⅰ组的血清及肺泡灌洗液CARDS TX、TNF-α、SAA水平高于Ⅱ组和Ⅲ组,且Ⅱ组高于Ⅲ组(P<0.05)。SAA曲线下面积(0.735)较TNF-α(0.711)、CARDS TX(0.705)高。结论 RMPP患儿CARDS TX、TNF-α、SAA表达水平较高,可能参与RMPP的致病过程,并可有效预测RMPP发生。

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆表达和生物学活性的鉴定

目的 利用原核表达系统表达具有生物学活性的产气荚膜梭菌α毒素。方法 设计针对α毒素基因的一对引物 ,用聚合酶链式反应 (PCR)技术扩增出α毒素的全基因。经测序确认正确后 ,回收的α毒素目的条带与 pGEX6 p - 1表达载体经限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后 ,进行连接 ,转化大肠杆菌BL2 1。诱导表达后 ,做SDS -PAGE电泳 ,出现特异的表达产物条带。表达产物做溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种小鼠实验。结果 构建的重组质粒经内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后 ,发现特异的目的基因条带。SDS -PAGE电泳后 ,发现重组菌株有特异的表达条带。实验证明表达产物具有溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种后致死小鼠特性。结论 重组菌株BL2 1(pGEX6p - 1-cpα)表达了具有活性的α毒素蛋白。目的 利用原核表达系统表达具有生物学活性的产气荚膜梭菌α毒素。方法 设计针对α毒素基因的一对引物 ,用聚合酶链式反应 (PCR)技术扩增出α毒素的全基因。经测序确认正确后 ,回收的α毒素目的条带与 pGEX6 p - 1表达载体经限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后 ,进行连接 ,转化大肠杆菌BL2 1。诱导表达后 ,做SDS -PAGE电泳 ,出现特异的表达产物条带。表达产物做溶血活性、卵磷脂水解活性和腹腔接种小鼠实验。结果 构?

丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用

目的研究丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路在金黄色葡萄球菌α-毒素所致人外周血单核细胞凋亡中的作用。方法以Annexin V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染流式细胞仪检测人外周血单核细胞的凋亡率,以Western blot法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、细胞外信号调节激酶(ERK)及c-Jun N末端激酶(JNK)等蛋白的表达。结果随着α-毒素作用时间的延长,磷酸化-p38 MAPK和JNK1/2等蛋白的表达逐渐增高,而磷酸化-ERK1/2蛋白的表达不变。用SB203580和SP600125阻断p38 MAPK和JNK1/2后,单核细胞凋亡率明显降低,分别为(17.7±1.8)%和(15.3±1.6)%,与感染60 min时(35.7±3.6)%比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MAPK信号通路的成员p38 MAPK和JNK1/2在金黄色葡萄球菌的致病过程中起重要作用。

感染A型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位

为了研究α毒素在感染A型产气荚膜梭菌动物的体内的分布情况,自制了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗,HRP和FITC分别标记的羊抗兔IgG作为二抗,通过免疫组化法对α毒素进行了定位检测。结果表明,在小鼠延髓、肠、肾、肺、胃的间充质细胞胞浆中发现了阳性颗粒,在脾、肝的间充质细胞中未发现毒素分布。结果提示,首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素,表明α毒素能突破血脑屏障进入延髓损坏生命中枢,这可能是引起动物死亡的一个重要原因。

腐败梭菌α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从腐败梭菌强毒株C5 5_1中 ,扩增出大小为 132 7bp的腐败梭菌α毒素全基因 (csa132 7基因 ) ,并将其克隆入 pMD18_T载体中。转化至受体菌DH5α后 ,经Amp/IPTG/X_Gal选择培养 ,提取质粒 ,PCR和EcoRⅠ /PstⅠ双酶切鉴定 ,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实 ,csa132 7基因开放阅读框架由 132 0bp组成 ,编码 4 4 0个氨基酸残基。与GenBank中登录的国外Fukushima 5株、Kagoshima 1株、Mie株和 4 4株的α毒素全基因相比 ,核苷酸同源率分别为 10 0 %、99 4 7%、99 2 5 %和 97 6 7% ,推导氨基酸的同源率分别达 10 0 %、10 0 %、99 7%和 97 0 6 %。表明本实验所克隆的csa132

Toll样受体2和4在金黄色葡萄球菌α-毒素诱导人单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用

目的研究金黄色葡萄球菌的α-毒素阳性菌株Wood46、RN6390和金黄色葡萄球菌主要毒力因子α-毒素感染人外周血单核细胞后Toll样受体(TLRs)的表达及细胞凋亡情况。方法用Annexin V/磺化丙啶双染流式细胞仪检测人单核细胞凋亡;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLRs在信使核糖核酸(mRNA)的表达情况。结果金黄色葡萄球菌α-毒素阳性菌株Wood46、RN6390和α-毒素感染人外周血单核细胞后发生凋亡,TLR2和TLR4在Wood46和RN6390感染后的表达均明显增加(P<0.01),α-毒素感染人单核细胞后,TLR2和TLR4的表达呈时间依赖性升高。结论α-毒素可诱导人单核细胞凋亡,增加TLR2和TLR4的表达,在金黄色葡萄球菌的致病过程中起重要作用。

产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立

为建立检测产气荚膜梭菌α毒素的方法,本研究以抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体为特异性检测抗体,对人工腹腔注射α毒素的病死兔器官组织进行免疫组化染色,经反应条件优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素的免疫组化检测方法。应用该方法对临床16例疑似产气荚膜梭菌病兔组织中的α毒素进行检测,同时进行病原菌分离鉴定。结果显示,该方法可以检测到人工感染兔心脏、肺脏、脾脏、肾脏、膀胱、肝脏、胃、小肠、盲肠和延脑中的α毒素分布,对照组则均为阴性,具有良好的特异性;临床应用检测结果表明:16例疑似病兔胃和肾脏中α毒素的检测均为阳性,检测阳性率高于细菌分离培养。本研究建立的该方法可以用于产气荚膜梭菌病的临床诊断,也为该毒素在动物机体内的分布规律及致病机理的研究提供了可靠的手段。

金黄色葡萄球菌α毒素对肺水通道蛋白表达的影响

目的:观察金黄色葡萄球菌α毒素(α-toxin)对Balb/c小鼠肺微血管内皮细胞(LMEC)水通道蛋白1(AQP1)表达的影响。方法:将实验组小鼠15只腹腔注入α-toxin后根据6h、10h、24h取材时间,随机将它们分为α-toxin6h组、α-toxin10h组和α-toxin24h组。取左肺行病理HE染色和免疫组化染色,检测肺组织病理变化情况和AQP1表达的变化。结果:α-toxin各组肺泡间隔增宽、水肿,炎性细胞浸润,肺泡结构破坏,以α-toxin10h组最为明显。免疫组化α-toxin各组AQP1表达下降(P<0.05)。其中以α-toxin10h组最为明显。α-toxin6h组和α-toxin10h组及α-toxin10h组和α-toxin24h组均有显著性差异(P<0.05)。结论:AQP1表达于LMEC。金葡菌α毒素可致小鼠肺LMEC的AQP1表达下降,随着炎症的减轻,AQP1也随之表达增加,进而恢复正常。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素mAb V_H和V_L基因的克隆与序列测定

用提取的Ａ 型产气荚膜梭菌α毒素包涵体为免疫原， 制备了１ 株ｍＡｂ ２Ｅ３ 。其Ｉｇ 亚类为ＩｇＧ３， 细胞培养上清和腹水的ｍＡｂ 效价分别为１∶１０２４ 和１∶１０８ 。该ｍＡｂ ２Ｅ３ 可中和α毒素的磷脂酶Ｃ 活性和溶血活性， 对α毒素致死性腹腔攻击的小鼠具有良好的被动保护作用。另外， 应用ＲＴＰＣＲ 技术， 从杂交瘤细胞株２Ｅ３ 中， 扩增出ｍＡｂ ＶＨ 和ＶＬ基因， 分别克隆至载体ｐＧＥＭＴ中。序列分析证实， ＶＨ 基因为３５７ ｂｐ， 编码１１９ 个氨基酸；ＶＬ 基因为３２４ ｂｐ， 编码１０８ 个氨基酸。计算机分析表明，ＶＨ 和ＶＬ基因均为新发现的基因序列， 符合功能性重排的鼠抗体可变区基因的特征。ＶＨ 和ＶＬ 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（ Ｂ） 和轻链κⅢ家族。

携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究

为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带的cpb2基因与14个菌株的非典型cpb2基因的氨基酸序列同源性为95.1%～98.9%,与典型cpb2基因(L77695)的氨基酸序列同源性为61.7%。这表明,G1的cpb2基因为非典型cpb2基因。同时分别将cpa和cpb2基因扩增产物克隆于原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-a和pET-b2,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,将其纯化后单独及联合免疫小鼠进行免疫保护试验。结果显示,单独免疫重组α毒素蛋白组以及联合免疫重组β2毒素蛋白组的小鼠,均可以抵抗至少6倍最小致死量(MLD)的G1外毒素(包含α毒素和非典型β2毒素)的攻击,也可以完全抵抗至少6 MLD的G2外毒素(不包含β2毒素)的攻击。表明,重组α毒素蛋白对含有及不含有非典型β2毒素的A型产气荚膜梭菌均具有良好的免疫保护作用。

甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌的作用研究

为了研究甘草总黄酮对金葡菌的抗菌活性以及亚抑菌浓度的甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响。首先,采用微量肉汤稀释法测定了甘草总黄酮对6株金葡菌标准菌株的最小抑菌浓度;其次,采用溶血试验、蛋白免疫印迹试验以及荧光定量PCR试验分别在表型功能、蛋白表达和基因转录3个层次确证了其对α-溶血素表达的影响。结果表明:甘草总黄酮具有良好的抗金葡菌作用,其最小抑菌浓度范围为4～16μg/mL,而亚抑菌浓度的甘草总黄酮能浓度依赖性地降低金葡菌α-溶血素的分泌。

产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

产气荚膜梭菌能引起人类食物中毒和出血性肠炎,严重时可导致死亡。α毒素是A型产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原,从分子生物学角度对该毒素进行研究具有重要意义。对α毒素的分子生物学结构和致病机理进行了简要概述,并介绍了国内外对产气荚膜梭菌α毒素的检测方法和防治措施,以期为研究产气荚膜梭菌α毒素的致病机理以及预防和治疗动物气性坏疽、肠道出血症奠定基础。

金葡菌α-溶血素致大鼠急性肺损伤时肺水通道蛋白AQP1表达的变化

目的观察金葡菌α-溶血素(α-Toxin)致急性肺损伤时大鼠肺部AQP1表达的变化。方法将24只健康雄性Wistar大鼠随机分为盐水对照组,α-Toxin 6h组,α-Toxin 10h组及α-Toxin 24h组,每组各6只。对照组给予腹腔内注入生理盐水;实验组则注入α-Toxin(5μg/100g),分别于6h、10h及24h采集标本。结果金葡菌α-Toxin可诱导大鼠急性肺损伤,肺组织出现不同程度的水肿、充血,动脉血氧下降,且损伤程度与毒素作用时间明显相关。免疫组化结果显示AQP1主要分布在肺微血管内皮,肺泡毛细血管内皮AQP1密度明显低于小血管内皮及细支气管旁毛细血管内皮(P<0.05)。注入α-Toxin后6h肺AQP1表达显著下降,10h下降达高峰,24h后AQP1表达有部分恢复(P<0.05)。结论α-Toxin可致大鼠肺损伤,并可同时下调肺AQP1表达,提示AQP1可能参与了金葡菌致急性肺损伤时肺内的异常液体转运。

微量法测定产气荚膜梭菌α毒素

为了快速、灵敏地测定样品中的产气荚膜梭菌α毒素，本实验以产气荚膜梭菌培养滤 液经硫酸铵分段盐析、丙酮分段沉淀及凝胶过滤得精制α毒素.在96孔细胞板上，经卵黄反 应浊度(微量)法测定精制α毒素及培养滤液卵黄反应滴度分别为1∶32 768和1∶2 048，且 该方法特异性强、稳定性好，是产气荚膜梭菌α毒素的一种快速、简便的检测手段.

腐败梭菌危害及防治的研究进展

腐败梭菌是专性厌氧菌,它可引起多种疾病,对畜禽养殖有较大危害.为了探讨有效控制该菌危害的方法,对国内外有关腐败梭菌病原学、致病机理、感染途径及发病症状和防治措施等情况进行综述.