卤代烷烃脱卤素酶标签α1A-肾上腺素受体色谱方法的建立与评价

受体色谱技术是将色谱技术的高分离能力和药物-受体间的高特异性识别能力结合起来的一种分析技术,能够对中药等复杂体系中靶向活性成分进行高效筛选与准确辨识。该技术的关键在于发展高效、温和、简便的固定化方法,使得固定化受体活性得以保持。传统的以生物交联剂为核心的随意共价固定化技术存在反应特异性较差、需要纯化蛋白质等不足。针对该问题,本研究将卤代烷烃脱卤素酶(Halo)与6-氯己酸的特异性生物正交反应引入至α_(1A)-肾上腺素受体(α_(1A)-AR)的固定化过程,将Halo标签α_(1A)-AR一步固定至6-氯己酸修饰的氨丙基硅胶表面,无需对α_(1A)-AR进行纯化。采用扫描电子显微镜和色谱法对Halo-α_(1A)-AR色谱固定相进行形貌及活性表征,证明受体已成功固定且具有特异性识别配体的能力,30天内稳定性良好。非线性色谱法研究结果显示:盐酸哌唑嗪、盐酸特拉唑嗪和乌拉地尔通过一类结合位点与Halo-α_(1A)-AR色谱固定相作用,结合常数分别为3.85×10^(5)、5.00×10^(5)和5.90×10^(5)L/mol;甲磺酸酚妥拉明和盐酸坦索罗辛在Halo-α_(1A)-AR色谱固定相上则存在两类位点,前者与受体亲和力分别为3.12×10^(6) L/mol和6.01×10^(5)L/mol,后者则为9.98×10^(5)L/mol和2.11×10^(4) L/mol。与传统物理吸附法或N,N′-羰基二咪唑法制备的α_(1A)-AR色谱柱相比,本文所用固定化方法无需纯化受体,在一定程度上避免了受体活性损失,实现了蛋白质一步固定化方法,亲和力测定值更接近于溶液中受体-药物的真值,为复杂体系靶向活性成分高效筛选与准确测定奠定了基础。

缺氧性肺动脉高压大鼠肺组织α_1肾上腺素受体亚型mRNA表达的研究

目的 了解α1肾上腺素受体 (α1 adrenergicreceptor,α1 AR)三种亚型α1A AR ,α1B AR和α1D ARmRNA在大鼠肺组织的表达位置及缺氧性肺动脉高压发病过程中大鼠肺组织α1 AR亚型mRNA相对表达量的改变情况。方法 采用雄性Wistar大鼠 5 5只 ,随机分为正常对照组 (n =10 ) ,缺氧 2周组 (n =13)、缺氧 4周组 (n =10 ) ,生理盐水组 (n =10 ) ,酚妥拉明组 (n =12 ) ,应用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)法 ,检测各组大鼠肺组织α1 AR三种亚型mRNA的相对表达量。应用组织原位杂交技术检测α1 AR三种亚型在正常大鼠肺组织中的表达部位。结果 ( 1)随缺氧时间的延长 ,肺动脉压力升高。 ( 2 )各实验组大鼠肺组织中α1 AR亚型mRNA的表达均以α1A AR为主 ,α1B AR次之 ,α1D AR含量最少。 ( 3)随缺氧时间的延长 ,α1A AR和α1B AR两种亚型mRNA相对表达量升高 ,缺氧 2、4周组与对照组差异有显著性 ,缺氧 2、4周组间差异亦有显著性。 ( 4 )随缺氧时间的延长 ,α1D ARmRNA的相对表达量增多 ,但缺氧组与对照组相比差异无显著性。 ( 5 )酚妥拉明组与生理盐水组比较 ,α1A AR ,α1B AR和α1D AR三种亚型mRNA的相对表达量差异均无显著性。 ( 6 )正常大鼠外周肺组织中三种α1 AR亚型的mRNA主要表达于肺小动脉和小静脉?