兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

目的:制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体。方法:PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因,将其克隆入原核表达载体pET28中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,用Ni2+-NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白,以之为免疫原免疫家兔,制备多克隆抗体,并用ELISA、Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果:成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/h CD1d-α3,高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白,间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6400,Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合,免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d。结论:通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原,免疫家兔,成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体。

纤溶酶原Kringle 5与层粘连蛋白α3链G1结构域间的结合及其对血管内皮细胞增殖凋亡的影响

目的探究层粘连蛋白α3链G1结构域(LG1)是否为人纤溶酶原Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对血管内皮细胞(HUVEC)的增殖和凋亡的影响。方法利用蛋白印记覆膜法(Blot overlay)及酶联免疫吸附试验(ELISA)技术考察重组Kringle 5与LG1间的结合能力;以紫杉醇作为阳性对照,不同浓度Kringle 5处理HUVEC;此外引入抗层粘连蛋白α3链抗体(抗LAMA3)并分成Kringle 5组(KR)、抗LAMA3+Kringle 5组(ALK)和Control组,细胞计数试剂盒(CCK-8)实验考察各组中内皮细胞的增殖和凋亡,组间比较采用单因素方差分析。结果Kringle 5可剂量依赖性地特异结合LG1,平衡解离常数为12.9×10^(-8) mol/L;细胞增殖实验中的Kringle 5处理组(180、260、340、420、500×10^(-9) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.59±0.03、0.48±0.02、0.36±0.04、0.25±0.01、0.25±0.01比0.72±0.01,F=52.211、340.650、187.178、3035.236、4044.002,P<0.05),且Kringle 5组(340、420、500×10^(-9) mol/L)的增殖抑制率高于紫杉醇组[(67.85±7.07)%、(87.15±2.28)%、(87.95±1.72)%比(48.04±7.84)%,F=10.561、68.783、74.115,P<0.05];细胞凋亡实验中,Kringle 5处理组(0.32、0.64、0.96、1.28、1.60、1.92×10^(-6) mol/L)的吸光度值低于空白组(0.47±0.03、0.45±0.02、0.40±0.04、0.30±0.03、0.28±0.03、0.26±0.01比0.59±0.04,F=14.122、22.986、28.333、111.968、112.113、184.012,P<0.05);KR组的增殖抑制率高于ALK组[(29.95±2.85)%、(43.60±0.23)%、(55.61±3.87)%比(-11.28±4.46)%、(-22.30±16.19)%、(-18.42±17.82)%,F=181.953、49.667、49.438,P<0.05],KR组的细胞存活率低于ALK组[(93.80±19.17)%、(53.79±1.10)%、(47.10±13.90)%比(139.97±26.99)%、(150.41±33.67)%、(115.08±30.04)%,F=5.837、24.689、12.649,P<0.05]。结论层粘连蛋白α3链为Kringle 5的特异性受体并介导了Kringle 5对HUVEC的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。