鼠层粘蛋白α5链G结构域E3和E8基因在毕赤酵母中的表达

为探索层粘连蛋白G结构域在甲醇型酵母(Pichia Yeast)中的表达,用PCR的方法获得了鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3(LG4-5)和E8(LG1-3)基因片段,并将其克隆到P.pastoris分泌型表达载体pPIC9中,构建了pPIC9-E3和pPIC9-E8等2个毕赤酵母重组质粒。将测序正确的质粒用电转化的方法转化酵母表达受体菌GS115,通过表型和PCR的方法筛选出P.pastoris重组子。用甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果表明,鼠层粘蛋白α5链G结构域的E3和E8片段在毕赤酵母中获得了成功的表达。

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。

COL4A5基因c.4518_c.4519 insC新突变所致X连锁显性遗传Alport综合征的分子遗传学及临床分析

目的:通过对胶原蛋白Ⅳ型α5链(collagen type Ⅳα 5 chain,COL4A5)基因进行分析,为1例X-连锁性遗传性Alport综合征家系的分子诊断和遗传咨询提供依据。探讨Alport综合征COL4A5基因移码突变谱及临床表型。方法:应用全外显子组测序技术进行基因检测,应用Sanger测序法对候选致病变异进行验证。结果:病人肾损害渐进展,出现肉眼血尿、肾病综合征,抗感染治疗后蛋白尿及肉眼血尿可缓解。先证者肾脏病理活检:病理表现为基底膜厚薄不一,致密层增厚,部分呈撕裂状和蛛网状。高通量测序和一代测序结果均提示病人COL4A5基因49号外显子存在c.4518_c.4519 insC(p.Gln1507Profs*14)的杂合变异;病人父母均不携带该变异。结论:首次报道了COL4A5基因该位点的新生变异为病人的发病原因,丰富了COL4A5基因变异谱,为该X-连锁性遗传性肾炎家系的分子诊断及产前诊断提供了依据;对指导家族中母亲及女儿再生育,通过产前基因诊断或胚胎植入前遗传学诊断技术,阻断该疾病有重要意义。

X-连锁Alport综合征的听力表现与皮肤α5(Ⅳ)胶原表达的关系

目的探讨中国人X连锁Alport综合征患者的听力表型与皮肤组织Ⅳ型胶原α5链表达的关系。方法收集2008年8月至2013年8月期间确诊为X连锁Alport综合征的31例患者临床资料,采用纯音听阈测试或ABR+40Hz相关电位检查+声导抗+耳声发射的方式进行听力评估,并采用免疫组化染色检测皮肤组织基膜Ⅳ型胶原α5链的表达,采用Pearson相关分析方法分析二者的关系。结果 31例X连锁Alport综合征中听力下降患者均表现为轻、中度感音神经性聋。听觉损害共28例(90.3%),其中22例男性中中度12例,轻度5例,轻微损害5例;女性6例,轻度3例,轻微损害3例。按皮肤Ⅳ胶原α5链染色分级,阴性17例均为男性,其中听力正常4例(3例OAE异常),听力下降13例(轻度4例,中度9例);大部阴性与可疑阳性各1例,均为男性,分别为中度和轻度;连续±2例(男性),正常和中度各1例;间断阳性3例均为女性,均为正常或轻度;连续++7例(男3,女4),其中听力正常4例,听力下降3例(2例轻度,1例中度)。染色阴性的11例听力下降患者听阈与年龄呈正相关(P=0.043,r=0.616)。结论 X连锁Alport综合征患者皮肤组织Ⅳ胶原α5链的表达男性低于女性,听力表现与皮肤组织Ⅳ胶原α5链的表达有一定的关系,其中Ⅳ胶原α5链表达阴性的患者听力下降程度与年龄存在相关性,但也存在听力正常的患者,说明还有其他因素影响患者的听力。皮肤组织中Ⅳ胶原α5链表达在一定程度上能反映耳蜗基底膜中Ⅳ胶原α5链的表达和功能。

从α5(Ⅳ)链mRNA突变分析看Alport综合征基因型和表型关系

目的 检测分析X连锁型Alport综合征(AS)患者α5(Ⅳ)链mRNA及其序列并探讨其基因型与表型之间的关系。方法 提取21例X连锁型AS患者的培养的皮肤成纤维细胞总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增覆盖全部α5(Ⅳ)链编码区的mRNA,经直接测序的方法分析。同时根据cDNA序列异常位置,应用PCR和直接测序的方法从基因组DNA水平分析COL4A5基因。结果 21例患者的mRNA分析均发现α5(Ⅳ)链序列异常,其中17个突变为新发现的突变。15例患者在mRNA水平检测到的结果与在基因组DNA检测到的结果一致;6例患者因发生剪接位点突变,在mRNA水平和基因组DNA水平检测到的COL4A5基因突变不一致。16/21例患者属于青少年型AS,2/21例属于成年型AS。结论 各种类型的COL4A5基因突变均可导致严重的临床表型,而且从mRNA水平分析AS基因型,可以发现并证实一些在基因组DNA水平无法发现和证实的异常。

肾组织石蜡切片免疫荧光检测在诊断X连锁Alport综合征中的应用

目的:建立X连锁Alport综合征(XLAS)肾组织石蜡切片型胶原A5链免疫荧光检测方法,探讨其临床应用价值。方法:将对照组及XLAS患儿各4例肾组织,分别行石蜡切片及冰冻切片型胶原A5链间接免疫荧光染色,比较分析染色结果。石蜡切片分别采用微波修复、胃蛋白酶消化及微波修复+胃蛋白酶消化三种抗原修复方法进行修复,比较三者的修复效果。结果:单独微波修复、胃蛋白酶消化均不能修复肾组织型胶原A5链,微波修复+胃蛋白酶消化法可修复A5链。组织经微波修复10min,胃蛋白酶消化10min后,肾小球基底膜型胶原A5链免疫荧光染色在对照组患儿为连续线状阳性表达,在X连锁遗传型女性患儿为间断线状阳性,男性患儿为阴性。结果均与冰冻切片免疫荧光染色结果一致。结论:经微波修复+胃蛋白酶消化双抗原修复法的石蜡切片免疫荧光检测肾组织型胶原A5链能较好地应用于XLAS诊断,可对既往临床不典型XLAS病例进行回顾性诊断,为XLAS的诊断和研究提供了一种可靠的技术手段。