α7尼古丁受体mRNA表达抑制对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响

目的探讨通过RNA干扰技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)中α7尼古丁乙酰胆碱受体(nAChR)基因表达后细胞氧化应激水平的变化,以了解该受体的神经保护作用。方法 SH-SY5Y细胞转染针对α7 nAChR的小分子干扰RNA,Real-time PCR法检测转染细胞中α7 nAChR mRNA水平蛋白质印迹方法检测蛋白表达水平;并用Aβ1～42处理培养细胞,比色法测定细胞脂质过氧化产物水平、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性。结果转染siRNA后,α7 nAChR mRNA水平和蛋白表达水平分别降低了81.7%和76.9%;细胞脂质过氧化水平升高38.4%;SOD和GSH-PX活性分别降低30.3%和21.1%。用Aβ1～42处理细胞后氧化应激水平升高,且转染siRNA后能增强Aβ的神经毒性作用。结论α7 nAChR基因表达抑制后能增强细胞氧化应激水平,同时增强Aβ的神经毒性作用。

α7尼古丁受体mRNA表达抑制对SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响

目的：探讨通过RNA干扰技术抑制神经母细胞瘤细胞（SH-SYSY细胞）中α7尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）基因表达后细胞氧化应激水平的变化，以了解该受体的神经保护作用。方法SH-SY5Y细胞转染针对α7MChR的小分子干扰RNA，Real-timePCR法检测转染细胞中α7nAChRmRNA水平蛋白质印迹方法检测蛋白表达水平；并用Aβ1-2处理培养细胞，比色法测定细胞脂质过氧化产物水平、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性。结果转染siRNA后，α7nAChRmRNA水平和蛋白表达水平分别降低了81．7％和76．9％；细胞脂质过氧化水平升高38．4％；SOD和GSH-PK活性分别降低30．3％和21．1％。用Aβ1-2处婵细胞后氧化应激水平升高，且转染siRNA后能增强Aβ的神经毒性作用。结论α7nAChR基因表达抑制后能增强细胞氧化应激水平，同时增强Aβ的神经毒性作用。

siRNA干扰CHRNA5基因的表达抑制尼古丁对人肺癌细胞的促增殖作用

目的:研究siRNA干扰尼古丁乙酰胆碱受体α5(cholinergic receptor nicotinic alpha5,CHRNA5)基因表达后对尼古丁促人肺癌A549细胞增殖作用的影响。方法:设计并合成CHRNA5-siRNA片段,并经脂质体介导转染A549细胞。荧光定量PCR、Western blotting检测转染后A549细胞中CHRNA5 mRNA和蛋白的表达,MTT法检测CHRNA5-siRNA对尼古丁促A549细胞增殖作用的影响。结果:成功构建了CHRNA5-siRNA并成功转染A549细胞。CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5mRNA表达量明显低于si-NC转染对照组(0.196±0.044vs0.944±0.027,P<0.01),CHRNA5-siRNA转染组A549细胞的CHRNA5蛋白表达量明显低于si-NC转染组(0.267±0.031vs0.745±0.035,P<0.01)。在无尼古丁作用时,CHRNA5-siRNA的转染不能抑制A549细胞的增殖。在尼古丁作用下,A549细胞增殖显著增加(P<0.01),CHRNA5-siRNA转染可明显抑制尼古丁的促增殖作用(P<0.01)。结论:siRNA下调肺癌A549细胞中CHRNA5的表达可以抑制尼古丁促细胞增殖作用,CHRNA5可能是肺癌治疗的潜在靶点之一。

尼古丁及尼古丁乙酰胆碱受体在肺癌发生发展过程中的作用

肺癌是目前世界上最常见的癌症之一,约占所有癌症病例的15%,而吸烟是目前公认的引起肺癌的主要危险因素之一,在发展中国家,约80%的肺癌病例与吸烟有关[1]。肺癌的预后总体上仍然不是很乐观,男性的5年生存率为6%-14%,女性为7%-18%[2]。在香烟烟雾约4,000多种化学物质中,已有60多种被确定为致癌物,它们大多通过与DNA相互作用,导致DNA加合物的形成,从而引起细胞中遗传物质或基因的改变。尼古丁是烟草的主要成分之一,其作用主要是导致吸烟者的成瘾性。

CHRNA5-A3-B4基因簇与吸烟行为及肿瘤发生关系的研究进展

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)是细胞膜上超家族配体门控离子通道受体,依赖尼古丁及其代谢产物的活性,激活各种代谢通路。这些代谢通路与肿瘤细胞的增殖、生存、迁移、侵袭、凋亡和血管生成有密切的联系,而CHRNA5-A3-B4是编码nAChRα5、α3和β4亚基的一组基因簇。研究证实,CHRNA5-A3-B4基因的多种单核苷酸多态性(SNP)与肿瘤的发生发展相关,这种突变的多样性,促进了更为主效的基因位点的探索,为肿瘤的靶向治疗提供依据。本文结合相关研究,从肺癌、食管癌及其他相关肿瘤疾病的发生来阐述CHRNA5-A3-B4相关SNP基因位点,以便获取主效基因位点。

灯盏细辛对神经细胞尼古丁受体表达的影响及其神经保护作用研究

目的研究中药灯盏细辛对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制。方法采用比色法测定细胞MTT还原率筛选药物浓度安全范围,选取一定浓度的灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处理SH-SY5Y细胞后,再加入Aβ1-42处理,测定MTT还原率,蛋白质印迹法(W estern b lotting)方法测定神经型尼古丁受体α3、α7蛋白表达的变化;采用改进的E llm an比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶(Ace-tylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)活性。结果灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能提高细胞α3及α7尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平;降低细胞乙酰胆碱酯酶活性;并能对抗Aβ引起的MTT还原率降低。结论灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上调尼古丁受体亚单位蛋白表达水平,降低细胞乙酰胆碱酯酶活性,且能对抗Aβ的神经毒性作用,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。

松果菊苷及异麦角甾苷对神经细胞尼古丁受体表达的影响

目的研究肉苁蓉活性成分松果菊苷及异麦角甾苷对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制,以了解其神经保护作用机制。方法比色法测定细胞MTT还原率筛选松果菊苷及异麦角甾苷安全浓度范围,并用Aβ25-35处理细胞后,测定MTT还原率,蛋白质印迹法(Western blot)测定尼古丁受体α3、α7蛋白表达的变化。结果松果菊苷及异麦角甾苷能提高细胞α3及α7神经型尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平,呈剂量依赖关系;并能对抗Aβ25-35引起的α3和α7受体亚单位蛋白质水平降低,减弱Aβ25-35引起的细胞损伤。结论松果菊苷及异麦角甾苷可能通过上调神经型尼古丁受体亚单位蛋白来发挥神经保护作用,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用。

灯盏细辛不同溶剂部位对神经细胞尼古丁受体水平影响比较研究

目的:研究中药灯盏细辛不同部位对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞神经型尼古丁受体水平的影响及其对抗β淀粉样蛋白(Aβ)细胞毒性作用机制。方法:比色法测定细胞MTT还原率筛选药物浓度安全范围,选取一定浓度的不同部位灯盏细辛处理SH-SY5Y细胞后,再加入Aβ1-42处理,测定MTT还原率,Western blotting(蛋白质印迹法)方法测定神经型尼古丁受体α3、α7蛋白水平的变化。结果:不同部位灯盏细辛能提高细胞α3及α7尼古丁受体亚单位蛋白水平;对抗Aβ引起的MTT还原率降低,其中以乙醇提取物乙酸乙酯部位及正丁醇部位最为明显。结论:灯盏细辛乙醇提取物中乙酸乙酯及正丁醇部位能明显上调细胞尼古丁受体亚单位蛋白水平,对抗Aβ引起的神经细胞存活率降低,对于进一步筛选具有神经保护作用的灯盏细辛有效成分提供一定的依据。

α5-烟碱型乙酰胆碱受体表达下调对肺癌细胞HIF-1α表达的影响

目的通过下调α5-烟碱型乙酰胆碱受体(α5-nAChR)的表达,体外研究尼古丁促肺癌细胞增殖过程中α5-nAChR对缺氧诱导因子(HIF-1α)表达的影响。方法以不同浓度尼古丁作用人肺腺癌细胞株A549,分别采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测A549细胞中α5-nAChR、HIF-1αmRNA和蛋白的表达。MTT法、实时荧光定量PCR、Western blotting检测CHRNA5-siRNA转染后,尼古丁促A549细胞增殖的作用和HIF-1α表达的变化。结果尼古丁浓度为1μmol/L时,α5-nAChR和HIF-1α表达明显升高(P<0.05),二者表达呈尼古丁浓度依赖性。CHRNA5-siRNA转染显著抑制α5-nAChR、HIF-1α表达(P<0.05),尼古丁促A549细胞增殖的作用明显受到抑制(P<0.05)。结论α5-nAchR通过调节HIF-1α的表达,在尼古丁促肺癌细胞增殖中起作用,提示α5-nAChR/HIF-1α信号轴可能是吸烟相关性肺癌发生的重要分子机制之一。

人重组白细胞介素-1受体拮抗剂对豚鼠离体气管平滑肌的影响

目的 观察人重组白细胞介素 1受体拮抗剂 (IL 1ra)对豚鼠离体气管平滑肌 (TSM)的影响。方法 用离体器官装置、张力换能器、MedLab记录系统测定TSM张力。结果 IL 1ra对正常TSM和卵白蛋白致敏TSM有直接舒张作用 ,EC50 分别为 8 0 6× 1 0 -8和 5 88× 1 0 -7mol·L-1 。IL 1ra可剂量依赖性抑制或拮抗His,ACh和 5 HT引起的气管收缩。但低浓度却增强ACh收缩作用。IL 1ra亦能显著抑制或对抗卵白蛋白致敏豚鼠的气管收缩 ,IC50 为 4 48×1 0 -7mol·L-1 。结论 在一定浓度范围内 ,IL 1ra对正常。

尼古丁受体CHRNA5亚基突变对其功能影响的初步研究

目的:研究CHRNA5亚基突变对尼古丁受体功能的影响。方法:通过RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,并通过重叠延伸PCR方法对CHRNA5亚基基因定点突变,从而构建CHRNA5突变型及野生型表达载体,然后转染至HEK293T细胞中,检测其基因表达。并将其分别与CHRNA3和CHRNB4共转至HEK293T细胞中,检测三质粒共转后的基因表达;通过采用尼古丁持续灌流细胞10 min,然后检测细胞内钙离子内流峰值的变化情况,接下来检测突变对转染后细胞活力的影响。结果:构建的CHRNA5表达载体在转染HEK293T细胞48 h后,能够检测到绿色荧光蛋白的表达,这证明重组载体已成功转染进HEK293T细胞;通过RT-PCR检测出转染细胞CHRNA5 m RNA表达,这证明CHRNA5突变型和野生型均在HEK293T细胞中成功进行了表达。通过尼古丁灌流细胞实验显示突变组和野生型组F340/F380峰值变化均值分别为0.865±0.048和0.447±0.127,突变体组峰值显著高于野生型组(P<0.05)。细胞活力检测实验发现0.01 m M和0.1 m M尼古丁刺激下突变组的细胞活力峰值分别为139%和137%,显著高于野生组的124%和126%,有显著差异(P<0.05)。结论:本研究成功构建了CHRNA5突变及野生型真核表达载体,发现CHRNA5的突变会导致其受体功能性改变,并影响细胞活力。

乙酰胆碱受体亚单位α5基因启动子区-10位T/A多态和肺癌易感性的关联分析

目的:研究中国汉族人群烟碱型乙酰胆碱受体亚单位α5(nicotine acetylcholine receptor subunits alpha5,CHRNA5)基因启动子区-10位T/A多态(rs503464)与肺癌遗传易感性之间的关系。方法:采用SNaPshot技术对505例经组织病理学确诊的肺癌患者和496例健康人的CHRNA5基因启动子区-10位T/A多态进行检测。结果:与携带纯合基因型TT/AA的个体相比较,杂合基因型TA携带者患肺癌的风险明显降低[校正后优势比(odds ratio,OR)=0.624,P<0.001]。等位基因频率分布在病例组和健康对照组间差异无统计学意义(P=0.97)。病理分型分析结果显示,杂合基因型TA携带者患肺腺癌和肺鳞癌的发病风险明显低于纯合基因型TT/AA携带者(OR值分别为0.597和0.542,均P=0.002)。分层分析后显示,这种保护作用在年龄大于60岁及无肿瘤家族史的人群中更显著(P<0.001)。结论:CHRNA5基因启动子区-10位杂合基因型TA可能与中国汉族人群罹患肺癌的遗传风险降低有关联。

α5-nAChR与MHC-I在肺腺癌中的表达及相关性

目的 探讨α5-烟碱型乙酰胆碱受体(alpha5-nicotinic acetylcholine receptor, α5-nAChR)与主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(major histocompatibility complex class I molecule, MHC-I)在肺腺癌中的表达及相关性。方法 TCGA数据库分析CHRNA5(编码α5-nAChR基因)与HLA-B(编码MHC-I基因)在肺腺癌中的表达、相关性及其临床意义。运用免疫组织化学技术检测人肺腺癌临床样本、裸鼠肺腺癌异种移植瘤组织中α5-nAChR与MHC-I的表达及相关性。在人A549细胞、小鼠LLC细胞中,Western blotting检测在α5-nAChR不同表达水平下的FHIT与MHC-I表达及相关性。结果 数据库分析表明,CHRNA5高表达或HLA-B低表达肺腺癌患者的生存率降低,CHRNA5与HLA-B的表达呈负相关(P<0.05)。α5-nAChR与MHC-I在人肺腺癌、裸鼠肺腺癌异种移植物中的表达呈负相关(P<0.05)。在肺腺癌细胞中,α5-nAChR的表达分别与FHIT、MHC-I的表达呈负相关(P<0.05),FHIT和MHC-I在肺腺癌细胞中的表达呈正相关(P<0.05)。结论 α5-nAChR与MHC-I的表达呈负相关,并参与肺腺癌的发生。

当归抗β-淀粉样蛋白所引起的神经细胞毒性作用研究

目的研究当归对β-淀粉样蛋白引起的SH-SY5Y神经细胞中尼古丁受体亚单位在蛋白质水平降低、细胞损伤及脂质过氧化的拮抗作用,了解其神经保护作用的可能机制。方法选取一定浓度的当归预处理SH-SY5Y细胞后,再加入β-淀粉样蛋白处理,用比色法测定细胞MTT还原率,从细胞整体水平了解当归对细胞活性的影响;用Western blotting方法测定神经型尼古丁受体亚单位(α3和α7)蛋白表达水平的变化;用TBA比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平,以了解当归的抗氧化能力。结果安全浓度的当归提取物能减弱β-淀粉样蛋白引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高,对抗β-淀粉样蛋白引起的α3和α7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低。结论当归有一定的神经保护作用。

α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记的合成及应用

目的:合成α-芋螺毒素AnIB[A11G]荧光标记物,并用于测定烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α3β2在小鼠脑内的分布。方法:利用两步氧化法设计合成α3β2高选择性抑制剂AnIB突变体AnIB[A11G],纯化后,用5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA-SE)标记,标记物鞘内注射到小鼠脑内,用激光扫描共聚焦显微镜测定α3β2在小鼠脑内的分布。结果与结论:获得了单一5-TAMRA-AnIB[A11G]荧光标记物,测定表明小鼠脑内nAChRα3β2主要分布于海马区域。

CHRNA5-A3-B4基因簇与吸烟行为的相关性研究进展

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)是一种配体门控离子通道受体,可与乙酰胆碱、尼古丁等物质结合而释放多种神经递质,进而参与物质的合成与分泌。CHRNA5-A3-B4基因簇位于nAChRs 15q25.1染色体上,可编码α5、α3、β4亚基,其可相互协调,共同调控基因位点,增强基因表达,影响生物性状。越来越多的研究发现,多种因素均可对吸烟行为产生影响,其中全基因组关联研究(GWASs)已明确CHRNA5-A3-B4基因簇与尼古丁依赖性和吸烟量具有强关联性。本文就CHRNA5-A3-B4基因簇与吸烟行为的相关性进行综述,以期为戒烟药物新靶点的开发和烟草相关疾病的基因干预治疗提供新思路。

CHRNA5基因表达下调对肺癌细胞VEGF表达的影响

目的体外研究非小细胞肺腺癌A549细胞中CHRNA5基因表达下调对尼古丁促肺癌细胞增殖及VEGF表达的影响。方法实验分为0μmol/L尼古丁组、1μmol/L尼古丁组、转染阴性对照组(1μmol/L尼古丁+si-NC)和转染组(1μmol/L尼古丁+CHRNA5-siRNA)。设计合成编码α5-nAChR的CHRNA5基因siRNA片段,脂质体介导转染A549细胞,RT-PCR检测CHRNA5-siRNA转染后α5-nAChR和VEGF mRNA水平的表达,Western blotting检测转染后α5-nAChR蛋白水平的表达,ELISA法检测转染后细胞上清液中VEGF蛋白水平的表达,CCK-8方法检测α5-nAChR下调对尼古丁促肺癌细胞增殖的影响。结果 CHRNA5-siRNA转染A549细胞后,转染组α5-nAChR和VEGF mRNA表达和蛋白表达量明显低于转染阴性对照组(P<0.05),且显著抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖(P<0.05)。结论α5-nAChR表达下调能抑制尼古丁促肺癌细胞的增殖,降低VEGF的表达。α5-nAchR及其信号转导系统在吸烟相关性肺癌发生、发展中可能发挥重要作用,可作为肺癌预后预测指标和治疗靶点。

参枝苓口服液对APP/PS1双转基因小鼠海马α7-nAChRs和mGluR5表达的影响

目的探讨参枝苓口服液对APP/PS1双转基因小鼠海马神经元突触信号传递相关蛋白α7-nAChRs和mGluR5表达的影响。方法将雄性3月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分成5组,模型组、多奈哌齐组[0.92 mg/(kg·d)],参枝苓大剂量组[50 g/(kg·d)]、参枝苓中剂量组[25 g/(kg·d)]、参枝苓小剂量组[12.5 g/(kg·d)]。正常组为同月龄同背景野生型C57BL/6J小鼠。连续灌胃3个月,进行行为学跳台实验。实验结束后取海马组织,运用蛋白印迹法(Western blot)和免疫组织化学方法检测小鼠海马CA1区突触相关蛋白α7-nAChRs和mGluR5的表达。结果 Western blot检测显示,模型组小鼠海马α7-nAChRs的蛋白条带比正常组小鼠明显变窄,颜色变浅(P<0.01)、而mGluR5蛋白条带明显增宽,颜色变深(P<0.01);与模型组小鼠相比,各干预组α7-nAChRs蛋白条带增宽、颜色变深(P<0.05或P<0.01),mGluR5蛋白条带变窄、颜色变浅(P<0.05或P<0.01)。免疫组织化学染色检测小鼠海马α7-nAChRs和mGluR5的阳性细胞表达结果与Western blot检测结果一致。结论参枝苓口服液可能是通过调节小鼠海马CA1区突触中的关键蛋白,改善突触功能发挥减缓阿尔茨海默病(AD)大脑损伤,维持记忆获得能力,从而发挥抗痴呆作用。

慢性失眠病人脑内神经递质活动的超慢涨落图表现

目的:探讨慢性失眠病人脑内神经递质活动变化。方法:用WF92型脑电超慢涨落分析仪,通过检测慢性失眠病人和正常人的脑电超慢涨落图(EFG),分析其谱线变化来反映脑内神经递质活动变化。结果:慢性失眠病人51例与51例健康人配对对照比较,EFG神经递质谱系S1和S2显著降低(配对t检验,P<0.01),S3、S4、S5、S7和S11两组间比较无明显差异,提示慢性失眠病人脑内神经递质谱系S1γ氨基丁酸(GABA)和S2谷氨酸(Glu)活动存在异常,S3乙酰胆碱受体(AchR)、S45羟色胺(5HT)、S5乙酰胆碱(Ach)、S7去甲肾上腺素(NE)和S11多巴胺(DA)活动无明显变化。结论:脑内神经递质GABA和Glu活动异常可能参与了慢性失眠的发病。