α7亚基烟碱乙酰胆碱受体在右美托咪定防治内毒素血症小鼠谵妄中的作用

目的观察d7亚基烟碱乙酰胆碱受体（α7nAChR）在右美托咪定（DEX）防治内毒素血症谵妄发生中的作用，并探讨其作用机制。方法将100只雄性C57BL／6小鼠按随机数字表法分为生理盐水对照组（Ns组）、DEX对照组、脂多糖（LPS）诱导内毒素血症模型组（LPS组）、DEX保护组（DEX＋LPS组）、α-银环蛇毒素拮抗组（α-BGT＋DEX＋LPS组），每组20只。采用腹腔注射LPS20mg/kg制备内毒素血症模型，Ns组和DEX对照组给予等量生理盐水。DEX对照组、DEX＋LPS组和α—BGT＋DEX＋LPS组小鼠于制模前15min腹腔注射DEX40ug／kg，α—BGT＋DEX＋LPS组于注射DEX前15min腹腔注射d7nAChR抑制剂α—BGT1ug／kg；Ns组给予等量生理盐水。制模前及制模后24h每组取10只小鼠进行旷场实验，实验结束后处死小鼠留取标本，采用酶联免疫吸附试验（ELlSA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平，蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）检测海马组织胆碱乙酰转移酶（ChAT）及乙酰胆碱酯酶（AChE）表达量。另取10只小鼠行新物体识别实验，观察训练阶段探究总时间及制模后3h和24h的偏好指数。结果Ns组和DEX对照组各项指标比较差异均无统计学意义。①旷场实验结果显示，制模前各组旷场实验观察指标均无差异。制模后24h，与NS组比较，LPS组小鼠表现为对新环境的认知、学习和记忆能力均下降，紧张度增加；DEX可明显改善小鼠的上述变化；而α-BGT可部分拮抗DEX对谵妄小鼠的保护作用。②新物体识别实验结果显示，与Ns组比较，LPS组小鼠探究新事物的能力下降；DEX可改善小鼠的探究能力；而α-BGT可拮抗DEX的保护作用。⑧ELISA结果显示，LPS组血清TNF-α和NSE水平较Ns组明显升高，DEX可抑制LPS诱导的血清TNF-α和NSE水平升高，而α-BGT可拮抗DEX的保护作用（Ns组、LPS组、DEX＋LPS组、α-BGT＋DEX＋LPS组TNF-α（ng／L）分别为23．72±3．13、808．78±87．86、192．96±31．47、829．99±80．98。NSE（-L）分别为8．70±0．74、25．90±3．03、18．10±2．14、23．12±2．21，均P〈0．01]。④WesternBlot结果显示，与Ns组比较，LPS组海马组织ChAT表达明显下降，AChE表达明显升高，DEX可逆转ChAT和AChE的表达变化，而α-BGT可拮抗DEX的保护作用[Ns组、LPS组、DEX＋LPS组、α-BGT＋DEX＋LPS组ChAT（灰度值）分别为1．536±0．150、0．381±0．138、0．914±0．173、0．628±0．088，AChE（灰度值）分别为0．382±0．201、1．843±0．325、0．898±0．155、1．470±0．220，P〈0．05或P〈0．01]。结论内毒素血症小鼠可发生谵妄等认知功能障碍；DEX可通过调节脑内神经递质AChE和ChAT的表达量而改善谵妄症状，从而起到脑保护作用，其机制可能与仅7nAChR有关。

单唾液酸神经节苷脂对帕金森病痴呆大鼠海马烟碱型乙酞胆碱受体α7亚基表达的影响

目的观察单唾液酸神经节苷脂(GM-1)对帕金森病痴呆(PDD)大鼠海马CA1区烟碱型乙酞胆碱受体(nAChRs)α7表达的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为空白对照组、阳性对照组、模型组、GM-1低剂量组GM-1中剂量组、GM-1高剂量组,每组7只。PDD模型建立后,给予GM-1低剂量组(10 mg/kg)、中剂量组(20 mg/kg)及高剂量组(40 mg/kg)大鼠GM-1腹腔注射,1次/d,共8周;阳性对照组给予多奈哌齐0.5 mg/kg灌胃,1次/d,共8周。采用Morris水迷宫实验观察各实验组大鼠行为学指标,逆转录实时荧光定量PCR检测海马nAChRα7 mRNA表达,Western blotting定量检测海马nAChRα7蛋白表达,免疫荧光双标检测nAchRα7及神经元细胞(NeuN)水平。结果与空白对照组相比,阳性对照组、模型组、GM-1低剂量组、GM-1中剂量组、GM-1高剂量组逃避潜伏期均延长,模型组、GM-1低剂量组、GM-1中剂量组穿越平台次数明显减少(均P<0.05)。与阳性对照组相比,模型组、GM-1低剂量组逃避潜伏期明显延长,模型组、GM-1低剂量组、GM-1中剂量组穿越平台次数明显减少(均P<0.05)。GM-1低剂量组nAChRα7 mRNA表达显著高于空白对照组、阳性对照组、模型组、GM-1中剂量组和GM-1高剂量组(均P<0.05)。与空白对照组及阳性对照组比较,模型组及GM-1中剂量组nAChRα7蛋白表达显著降低(均P<0.05)。模型组nAChRα7蛋白表达显著低于GM-1低剂量组及GM-1高剂量组(均P<0.05)。与空白对照组及阳性对照组比较,GM-1低剂量组、中剂量组nAchRα7显著降低,GM-1低剂量组、中剂量组及高剂量组NeuN显著降低(均P<0.05)。与模型组比较,GM-1低剂量组nAchRα7、NeuN及GM-1中剂量组NeuN均显著降低(均P<0.05)。GM-1高剂量组nAchRα7显著高于低剂量组(P<0.05)。结论 GM-1可通过提高PDD大鼠海马CA1区nAChRα7的表达,改善认知功能。高剂量(40 mg/kg)GM-1的改善作用更明显。

烟碱抑制RAW264.7细胞表达和释放HMGB1的机制

目的:探讨烟碱抑制RAW264.7细胞HMGB1表达和释放的机制。方法:(1)RAW264.7细胞在6孔板分组培养:仅加培养液为对照组(C);加LPS250μg/L为LPS组(LPS);在LPS基础上加烟碱1μmol/L和10μmol/L分别为烟碱1组(N1)和烟碱2组(N2)。培养24h后,RT-PCR检测各组细胞HMGB1 mRNA表达水平;Western blotting检测上清液和胞浆、胞核HMGB1含量。(2)用鼠α7nAChR基因反义和正义链RNA转染培养细胞后,再加含LPS250μg/L和10μmol/L烟碱于培养液分别作为反义链组(antisense RNA)和正义链组(senseRNA);以上述C组和LPS组为对照,2h后Western blotting检测上清液HMGB1量。结果:(1)C组细胞HMGB1 mRNA呈低水平表达(1659.20±121.05);细胞HMGB1 mRNA表达水平在N1和N2组及LPS组间差异无显著(P>0.05)。(2)LPS组上清液的HMGB1量较高(445.34±28.52);N1和N2组上清液的HMGB1量显著低于LPS组(P<0.05)。(3)C组胞核HMGB1量较高(335.46±12.24);而LPS组胞核HMGB1量明显低于对照组(P<0.05);N1组和N2组胞核HMGB1显著高于LPS组(P<0.05)。(4)AntisenseRNA组与LPS组比,培养液中HMGB1量无显著差异(P>0.05);senseRNA组与LPS组比,HMGB1含量明显减少(P<0.05)。结论:烟碱对RAW264.7细胞释放HMGB1有明显抑制作用;其主要机制可能是通过与α7nAChR特异结合而影响HMGB1的核转位。

远志总皂苷对AD模型大鼠学习记忆及海马nAChRα7亚基的影响

目的观察远志总皂苷(TEN)对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠学习记忆及烟碱型乙酰胆碱受体α7(nAChRα7)亚基的影响,探讨TEN对AD干预作用的机制。方法将雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组、TEN低剂量组(12.5mg/mL)和TEN高剂量组(37.5mg/mL),每组8只。模型组予腹腔注射D-半乳糖(D-gal)致衰联合IBO损毁双侧基底前脑Meynert核建立AD模型。TEN低、高剂量组在建立AD模型的同时分别予12.5mg/mL、37.5mg/mL的TEN灌胃8周。对照组用等体积的生理盐水代替D-半乳糖(D-gal)和IBO注射。采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠的逃避潜伏期(EL)、跨越原平台次数和原平台象限停留时间;用免疫组化法测各组大鼠海马区nAChRα7表达水平。结果与对照组比较,模型组EL延长、跨越原平台次数减少、原平台象限停留时间降低、海马区nAChRα7的表达水平减小(P<0.05);与模型组比较,TEN高、低剂量组EL缩短、跨越原平台次数增加、原平台象限停留时间延长、海马区nAChRα7的表达水平增高(P<0.05)。与TEN低剂量组比较,TEN高剂量组EL时间缩短(但实验第2天两组间比较无统计学差异)、跨越原平台次数增加、原平台象限停留时间延长、海马区nAChRα7表达水平均明显升高(P<0.05)。结论 TEN可显著提高AD模型大鼠海马区nAChRα7表达,这可能是TEN改善学习记忆和认知功能的机制之一。

烟碱型乙酰胆碱受体α7亚基在帕金森病细胞模型中调控多巴胺神经元的作用机制

目的分析烟碱型乙酰胆碱受体(Nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)α7对人神经母细胞瘤细胞(Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)增殖及凋亡的影响,阐明α7nAChR可以通过正向调控多巴胺(Dopamine,DA)神经元的表达来发挥其生物学功能,从而治疗帕金森病。方法本实验通过选取SH-SY5Y细胞系进行细胞培养、复苏、传代、制作帕金森病细胞模型以及细胞转染;实验分组为对照组、模型组、α7nAChR过表达组、α7nAChR过表达空载组;分别进行细胞增殖实验(Cell counting kit-8,CCK8)检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测多巴胺(DA)的表达水平;Western blot检测α7nAChR、磷酸化钙调素依赖性蛋白激酶2(Phosphorylated calmodulin kinaseⅡ,p-CAMKⅡ)、磷酸化细胞外信号调节激酶(Phosphorylated extracellular signal regulated kinase,p-ERK)、磷酸化Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Phosphorylated Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,p-Ras)的蛋白表达水平;免疫荧光检测酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)、α7nAChR、α-突触核蛋白(Alpha synuclein,αSYN)的表达水平。结果Model组α7nAChR的蛋白表达水平较Control组显著降低(P<0.05),而α7nAChR-OE组的蛋白表达水平较Model组显著升高(P<0.05)。CCK8表明,Model组细胞的增殖活性较Control组显著降低(P<0.05);α7nAChR-OE组细胞的增殖活性较Model组显著升高(P<0.05)。流式细胞术表明,Model组细胞的凋亡率较Control组显著升高(P<0.05);α7nAChR-OE组细胞的凋亡率较Model组显著降低(P<0.05)。Model组的αSYN水平较Control组显著升高(P<0.05);α7nAChR-OE组的αSYN水平较Model组显著降低(P<0.05)。Model组的TH,α7nAChR,DA水平较Control组显著降低(P<0.05);α7nAChR-OE组的TH,α7nAChR,DA水平较Model组显著升高(P<0.05)。Model组的Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,KRAS),CAMK II,ERK的蛋白磷酸化水平较Control组显著升高(P<0.05);α7nAChR-OE组的KRAS,CAMK II,ERK的蛋白磷酸化水平较Model组显著降低(P<0.05)。结论α7nAChR的高表达能促进帕金森病模型细胞的增殖、抑制凋亡,且α7nAChR可以通过抑制Ca^(2+)/CAMK/ERK通路活性来发挥神经保护作用,提高DA神经元表达,改善帕金森病的症状。

激动α7nΑCHRs对脓毒症小鼠血小板的影响

目的：观察激动α7亚基烟碱型乙酰胆碱受体（α7nΑCHRs）对脓毒症小鼠血小板的影响。方法：将30只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法随机分为3组：假手术组（sham组）、盲肠结扎＋穿孔组（CLP组）、CLP＋α7nΑCHRs激动组（CLP＋GTS-21组）,每组10只。于模型制备成功后24h采血,检测血小板计数和血小板表面CD62P的表达。结果：血小板计数：CLP组血小板计数较sham组明显下降（P〈0.05）,CLP＋GTS-21组血小板下降程度明显减轻（P〈0.05）,但CLP＋GTS-21组血小板计数仍低于sham组（P〈0.05）。血小板CD62P的表达：sham组、CLP组、CLP＋GTS-21组血小板CD62P的表达均无明显差异（P〉0.05）。结论：脓毒症小鼠会发生明显的血小板减少,激动α7nΑCHRs可以缓解脓毒症小鼠血小板减少,检测血小板CD62P的表达水平不能反映脓毒症小鼠血小板的活化。

烟碱对油酸型急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征大鼠肺组织中NF-κB及HMGB1表达的影响

目的探讨胆碱能抗炎通路被烟碱激活后对急性肺损伤的治疗作用,并研究其作用机制,为急性肺损伤的治疗寻找新的途径。方法将用油酸制备的32只急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)雄性大鼠模型随机分为4组,每组8只,4组分别为对照组、烟碱处理组(烟碱组)、ARDS组、烟碱与α-银环蛇毒素处理组(蛇毒素组),试验中测肺湿干重比、氧分压,制备肺组织病理切片,采用WESTERN-BLOTTING法检测肺组织中NF-κB p65、HMGB1(高迁移率族蛋白)值,ELISA法测大鼠血液中白介素-6(IL-6)值。结果 ARDS组、蛇毒素组大鼠肺组织病理改变较烟碱组明显加重;IL-6的浓度、动脉血氧分压(PaO2)、NF-κB p65及HMGB1的灰度值、肺湿干重比(W/D),ARDS组及蛇毒素组与烟碱组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论烟碱通过作用于烟碱受体的α7亚基激动胆碱能抗炎通路,能明显减少炎症因子的表达,对肺组织具有保护作用。

对胆碱能抗炎通路研究的新认识

炎症反应是机体对损伤和感染所表现出来的红肿热痛，在保护机体免受侵害的过程中起到很重要的作用。免疫系统是机体抵御病原体入侵的第一道防线，其功能正常对机体的存活是至关重要的。