ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体的活性研究

分析和检测了ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC对α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)的结合活性,并用重组表达在非洲爪蟾卵母细胞膜上的大鼠α9α10 nAChR受体,分别评价了2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在常规的ND96灌流液和不含钙离子的钡离子ND96灌流液(Ba2+ND96)中对该受体的阻断活性.研究表明,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC在Ba2+ND96灌流液中对α9α10 nAChR没有抑制作用,而它们在常规的ND96灌流液中却表现出微弱的抑制活性,这应是受钙离子激活产生的氯离子电流影响的结果.因此,2个ω-芋螺毒素MVIIA和MVIIC并不是α9α10 nAChR的有效阻断剂,其作用机理与α-芋螺毒素Vc1.1和Rg IA完全不同.本研究阐明了芋螺毒素抑制α9α10 nAChR和钙离子通道的机理,这对研发新型的芋螺毒素镇痛药和更好地治疗顽固性疼痛具有很重要的科学意义.

αB-芋螺毒素VxXXIVA与α9α10乙酰胆碱受体结合特性的研究

目的对αB-芋螺毒素VxXXIVA与其受体α9α10乙酰胆碱受体(nAChR)之间的结合特性进行研究。方法利用非洲爪蟾卵母细胞表达大鼠α9α10乙酰胆碱受体,通过变换膜电压,以及与α-芋螺毒素RgIAm的竞争性结合实验,测定α9α10乙酰胆碱受体电流与洗脱速率的变化。结果αB-芋螺毒素VxXXIVA与具有竞争性结合特性的α-芋螺毒素的结合位点有部分重叠,但又不完全相同,是1个新的微位点,其受体结合活性随膜电压的升高而不会改变,不具有电压依赖性。结论获知了具有独特结构的αB-VxXXIVA与受体α9α10nAChR之间的结合特性,该研究结果将为αB-VxXXIVA作为工具药开发、α9α10nAChR受体结构与功能的研究、以及基于该受体为药靶的药物设计提供理论基础。

N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠内耳耳蜗及前庭中的表达

目的研究N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节中的表达。方法运用RT-PCR技术分别检测大鼠前庭终器、Scarpa’s神经节、基底膜、螺旋神经节编码N型乙酰胆碱受体α10亚基的基因表达。以大鼠脑组织RNA为阳性对照。结果N型乙酰胆碱受体α10亚基在大鼠前庭终器、基底膜上有表达,在Scarpa’s神经节、螺旋神经节中无表达。结论在前庭终器和基底膜上扩增出标志N型乙酰胆碱受体α10亚基基因表达的PCR产物,为乙酰胆碱是内耳重要的神经递质之一提供了支持,并为N型乙酰胆碱受体在内耳中的传入-传出调节中的作用提供了依据。

烟碱型乙酰胆碱受体激动剂GTS-21对鼠实验性结肠炎的影响

目的:通过建立葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的鼠结肠炎模型,探讨alpha7烟碱型乙酰胆碱受体(alpha7 nicotinic acetylcholine receptor,α7n ACh R)激动剂GTS-21改善模型鼠结肠炎症的效果及可能机制。方法:8~10周龄SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照(CON)组、DSS模型组、GTS-21治疗组(每组8只)。DSS模型组采用自由饮用含3.5%DSS水造模,治疗组自由饮用3.5%DSS水,同时给予GTS-21[10 mg/(kg·d),腹腔注射],共7 d,对照组予生理盐水,每天予各组鼠疾病活动性评分(DAI评分)。第8天处死小鼠,观察结肠黏膜组织大体改变并测其长度、湿重,HE染色后行肠组织学炎症(HI)评分;细胞因子芯片筛选变化的细胞因子;ELISA法进一步检测芯片筛选出的变化明显的细胞因子。结果:(1)DSS组鼠结肠长度变短[(8.22±0.37)cm vs.(11.65±0.30)cm,n=8,P<0.001],DAI评分较正常组增高[(1.51±0.10)分vs.0分,n=8,P<0.001],HI评分升高[(20.5±3.9)分vs.(0.9±0.4)分,n=8,P<0.001],表明造模成功;(2)给予烟碱型乙酰胆碱受体激动剂GTS-21的DSS模型鼠,DAI评分下降[(0.25±0.10)分vs.(1.51±0.10)分,n=8,P<0.001];结肠长度较DSS组改善[(9.42±0.32)cm vs.(8.22±0.37)cm,n=8,P<0.05];HI评分减低[(7.5±2.0)分vs(20.5±3.9)分,n=8,P<0.01],提示GTS-21能改善DSS诱导的鼠结肠炎症;(3)细胞因子芯片筛选实验结果表明,DSS组γ干扰素诱导单核细胞因子(monokine induced by IFN-γ,CXCL9/Mig)升高最明显,此外肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、γ-干扰素(interferonγ,IFN-γ)也明显升高;(4)进一步ELISA检测芯片变化最明显的CXCL9/Mig,发现DSS组鼠血清CXCL9/Mig明显升高(P<0.05),给予GTS-21后,血清CXCL9/Mig降低(P<0.05)。结论:GTS-21能减轻实验结肠炎鼠肠道炎症,该作用可能与减低趋化因子CXCL9/Mig水平,进而减少炎症细胞的肠道聚集有关。

芋螺毒素Lv68的一步氧化及其对乙酰胆碱受体的阻断活性

本研究通过固相合成法合成芋螺毒素Lv68线性肽,研究并优化了其主要异构体的一步氧化折叠条件,并通过电压膜片钳技术对主异构体产物进行了多种乙酰胆碱受体亚型(α3β4,α6β4,α4β2,α9α10,α1β1γδ,α1β1δεnAChRs)的活性测试,旨在为以烟碱型乙酰胆碱受体为靶点的先导药物分子的发现奠定基础,同时为该类其他芋螺毒素的氧化折叠方法、生物活性研究以及深入开发利用提供参考和借鉴。结果表明,芋螺毒素Lv68的一步法氧化折叠最优条件为反应体系组成为0.1 mol·L^−1 Tris-HCl,1 mmol·L^−1 EDTA,GSH/GSSG 1 mmol·L^−1/1 mmol·L^−1,线性肽浓度为50μmol·L^−1,反应时间为2 h,产率高达18.14%,Lv68折叠肽在1μmol·L^−1浓度下对α9α10 nAChR具有较好的阻断作用(阻断率约80%)。本研究明确了芋螺毒素Lv68的一步氧化折叠条件,证实了Lv68对α9α10乙酰胆碱受体亚型具有阻断活性,拓宽了含半胱氨酸框架Ⅲ的M超家族芋螺毒素的作用靶点范围。

孤儿核受体SHP敲减抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化

孤儿核受体SHP(small heterodimer partner)是核受体超家族中的一员,具有LXXLL模体及配体结合域,但无经典的DNA结合域.它可与多种转录因子结合,调节细胞的增殖、分化和代谢等生物学过程.但目前关于SHP在BMP9诱导成骨分化中的确切作用却尚不清楚.本研究证明,SHP参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化.RT-PCR结合Western印迹方法检测蛋白揭示,异位表达BMP9上调了SHP在C3H10T1/2细胞中的表达.小干扰RNA敲减SHP基因在C3H10T1/2细胞的表达下调了成骨相关基因Runx2、Id1、Id2及CTGF的表达,而过表达BMP9则可上调这些基因的表达.碱性磷酸酶(ALP)活性测定/染色及茜素红染色显示,敲减核受体SHP基因可抑制BMP9的成骨分化作用,而过表达BMP9可部分消除SHP敲减导致的成骨抑制作用.上述结果提示,核受体SHP为BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化所必需.究竟BMP9如何上调SHP基因表达,以及SHP究竟通过何种机制上调BMP9下游成骨分化相关基因的表达尚待进一步研究.

血清ADA、IL-10及TLR9与EBV相关传染性单核细胞增多症患儿EBV-DNA载量的相关性

目的分析血清腺苷脱氨酶(ADA)、白细胞介素-10(IL-10)及Toll样受体9(TLR9)与EB病毒(EBV)相关传染性单核细胞增多症(IM)患儿EBV-DNA载量的相关性。方法前瞻性选择2021年2月至2022年12月就诊于该院的98例EBV相关IM患儿作为IM组,另选同期于该院体检的50例健康儿童作为对照组。比较对照组、IM组血清ADA、IL-10及TLR9水平,线性回归分析ADA、IL-10、TLR9水平与IM发生的关系,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ADA、IL-10、TLR9水平单独及联合预测IM发生的价值。根据EBV-DNA载量不同将IM组患儿分为低载量组(18例)、低-中载量组(25例)、中-高载量组(49例)、高载量组(6例)4个亚组,比较各组血清ADA、IL-10及TLR9水平,Spearman等级相关分析血清ADA、IL-10、TLR9水平与IM患儿EBV-DNA载量的关系。结果与对照组比较,IM组血清ADA、IL-10、TLR9水平升高(P<0.05);线性回归分析结果显示,ADA、IL-10、TLR9水平均与EBV相关IM的发生有关(P<0.05);ROC曲线结果发现血清ADA、IL-10、TLR9水平单独及联合预测EBV相关IM发生的曲线下面积分别为0.850(95%CI 0.791~0.910)、0.867(95%CI 0.811~0.924)、0.891(95%CI 0.840~0.943)、0.912(95%CI 0.843~0.956);血清ADA、IL-10、TLR9水平及EBV-DNA载量从高到低为高载量组、中-高载量组、低-中载量组、低载量组(P<0.05);Spearman等级相关结果显示,血清ADA(r=0.526,P<0.001)、IL-10(r=0.610,P<0.001)及TLR9(r=0.715,P<0.001)水平与EBV相关IM患儿EBV-DNA载量呈正相关。结论EBV相关IM患儿血清ADA、IL-10及TLR9水平异常升高,上述指标水平与EBV-DNA载量密切相关,且三者联合可有效预测EBV相关IM的发生。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞Toll样受体9的表达及血清白介素-10水平的研究

目的:研究Toll样受体9(TLR-9)在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)上的表达水平及SLE患者血清白介素-10水平,探讨发病机制。方法:从23例活动期、19例缓解期SLE患者和20例正常对照组中分离PBMCs,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBMCs中TLR9 mRNA的表达水平,利用酶联免疫吸附试验法检测其血清白介素-10水平。结果:活动期SLE患者PBMCs的TLR-9mRNA表达高于缓解组(P<0.01)及正常对照(P<0.01),缓解期和正常对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。SLE活动期患者血清IL-10水平显著高于缓解期患者(P<0.01),并均高于正常对照组(P<0.01)。结论:活动期SLE患者PBMC的TLR9 mRNA的表达水平增高;并且活动期及缓解期SLE患者血清IL-10水平升高可能与TLR9 mRNA表达的上调相关。

重组人白细胞介素10抗家兔皮肤移植排斥反应中Toll样受体的变化

背景:现已认识到Toll样受体的活化与器官移植后排斥反应的关系十分密切,Toll样受体与移植免疫也逐渐成为研究的热点问题。目的:观察重组人白细胞介素10抗皮肤移植排斥反应中受体兔血清Toll样受体的变化。方法:制备兔背部缺损模型,将受体家兔分为6组,重组人白细胞介素10低、高剂量组、环孢素A低、高剂量组、联合用药组和生理盐水组,分别于移植前1d开始肌肉注射5,10μg/(kgd)重组人白细胞介素10,5,10mg/(kgd)环孢素A,5μg重组人白细胞介素10+5mg环孢素A,1mL/d生理盐水,连续用药10d。结果与结论:各组移植后Toll样受体4,7,8,9水平均较移植前升高,移植后14d达到高峰。移植后4,7d生理盐水组Toll样受体4水平高于联合用药组(P<0.05)。移植后7d生理盐水组Toll样受体7高于其他各组(P<0.05),Toll样受体8高于环孢素A高剂量组(P<0.05)。各组移植不同时间点Toll样受体9水平差异无显著性意义(P>0.05)。提示重组人白细胞介素10抗家兔皮肤移植反应中,Toll样受体4,7,8,9水平在皮肤移植后明显升高,当皮片排斥后达到高峰,之后逐渐下降,表明Toll样受体参与排斥反应过程。

TLR9联合CD40信号对ITP患儿外周血中IL10^+CD3^-细胞亚群改变的研究

目的:探讨TLR9联合CD40信号对儿童免疫性血小板减少症(ITP)患儿外周血单个核细胞(PBMC中CD3^-细胞表达IL-10的作用及影响。方法:采用流式多因子阵列检测技术,分析8例ITP患儿和7例正常对照血浆样本中IL-10含量;分离8例ITP患儿及7例正常对照外周血PBMC,并经CpG联合CD40L体外刺激培养5 h,采用流式胞内外染色及检测技术,比较ITP患儿与正常对照组PBMC中CD3^-和CD3^+亚群比例、IL-10表达能力及细胞存活率的差异。结果:ITP患儿血浆中IL-10含量显著高于正常对照组(P<0.05);CpG联合CD40L刺激后的ITP患儿和正常对照组PBMC中CD3^-细胞比例与未刺激组相比均显著升高,而CD3^+T淋巴细胞比例显著下降(P<0.05);ITP患儿刺激组中CD3^-IL-10^+细胞的比例显著高于正常对照刺激组(P<0.05);与正常对照组相比,未刺激组ITP患儿CD3^-细胞存活率显著下降(P<0.05)。结论:TLR9联合CD40信号的活化能导致ITP患儿外周血IL10^+CD3^-细胞比例升高,细胞死亡率升高,可能与ITP疾病进展有重要关系。

α9α10烟碱型乙酰胆碱受体相关疾病研究进展

乙酰胆碱受体（AChRs）是自然界普遍存在的一种具有重要生理功能的膜蛋白,能调节生物体一系列的生理功能,如：痛觉、认知、记忆、焦虑等。按照对配体敏感性的不同,AChRs分为毒蕈型乙酰胆碱受体（mAChRs）和烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）两大类。其中nAChRs按照不同分布又可分为肌肉型nAChRs和神经型nAChRs两大类。

限制性内切酶策略鉴定CRISPR/Cas9介导的Chrm3基因敲除小鼠

CRISPR/Cas9技术是近年发展起来的快速基因编辑技术。通过该技术已对多种生物的基因组进行了编辑。由此产生的基因编辑动物的建系与鉴定是随之而来较为繁琐的工作。单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA)靶序列的设计和确定不仅影响后续靶向基因组的效率,还可作为优化鉴定、筛选方法的参考。本研究在选取sgRNA靶序列时,不仅依据软件的评分,还分析了sgRNA靶序列是否含有酶切位点,以便对后续纯合子/杂合子进行鉴定。结果显示,以特异引物扩增的野生型小鼠Chrm3基因片段可被限制性内切酶BanⅡ切为两个片段;而纯合子小鼠"丢失"该酶切位点,其PCR产物不能被切开;杂合子小鼠PCR产物被不完全切开,凝胶电泳结果可见三条带。本研究结果提示该策略可有效简化基因编辑动物建系鉴定工作,提高鉴定效率及改善阳性动物辨识效果。

重症肌无力被动转移大鼠模型的建立及基质金属蛋白酶9表达的改变

目的研究mAb35建立重症肌无力被动转移大鼠模型(passive transfer myasthenia gravis,PTMG)的方法,探讨基质金属蛋白酶9(MMP-9)在PTMG中的表达及意义。方法用乙酰胆碱受体(acetylcholine re-ceptor,AChR)特异性单克隆抗体mAb35建立PTMG动物模型,应用HE染色观察大鼠腓肠肌炎性细胞浸润情况,应用免疫荧光技术观察大鼠腓肠肌AChR数量改变,用ELISA方法检测血清AChR抗体改变,应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法研究MMP-9在PTMG腓肠肌基因水平表达变化。结果 PTMG Lewis大鼠模型成模率为100%。光镜下可见PTMG组肌肉炎性细胞浸润增多,荧光显微镜下可见PTMG组腓肠肌AChR数量相对对照组表达明显下调。PTMG组血清AChR抗体量〔(1431±102.9)ng/mL〕明显高于健康对照组〔(364.8±15.8)ng/mL〕(P<0.05)。PTMG组腓肠肌MMP-9mRNA相对表达水平(AMMP-9/AGAPDH=0.693±0.152)高于健康对照组(AMMP-9/AGAPDH=0.132±0.026)(P<0.01)。结论 MMP-9表达增加可能与PTMG发病有关。

PCDH10减少多发性骨髓瘤细胞逃避表阿霉素杀伤

目的:探讨原钙黏蛋白10(protocadherin-10,PCDH10)对表阿霉素杀伤多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞的影响及机制。方法:采用脂质体法将PCDH10基因转染入人MM细胞株RPMI8226细胞,RT-PCR和Western blot法检测PCDH10基因和蛋白的表达;CCK-8法检测表阿霉素对RPMI8226细胞的增殖抑制作用,求得半数抑制浓度(half-maximal inhibitory concentration,IC50);Transwell法检测表阿霉素和PCDH10对RPMI8226细胞迁移的影响;流式细胞术检测CXC族趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4,CXCR4)蛋白表达;Western blot方法检测Ras同源家族成员A(ras homolog gene family member A,Rho A)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达情况。结果:PCDH10基因成功转染入RPMI8226细胞,并成功表达;PCDH10转染组表阿霉素IC50为(0.87±0.07)μg/ml,明显低于空质粒转染组(1.27±0.02)μg/ml(F=77.93,P=0.000);PCDH10减少表阿霉素所致的细胞迁移(F=34.943,P=0.000)并抑制CXCR4(F=117.269,P=0.000)、Rho A(F=1 818.250,P=0.000)和MMP-9(F=523.764,P=0.000)蛋白表达。结论:PCDH10一方面可增强MM细胞对表阿霉素的敏感性,另一方面可通过抑制CXCR4、Rho A、MMP-9蛋白的表达来减少MM细胞逃避表阿霉素的杀伤,从而增强了表阿霉素的抗骨髓瘤效应。

CXC趋化因子受体3变体及其配体在肿瘤微环境中作用的研究进展

恶性肿瘤是严重威胁人类生命的疾病之一,近年来免疫治疗已经成为肿瘤治疗的焦点,解决免疫治疗只对部分患者有效的问题迫在眉睫。在肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中趋化因子介导细胞的定向移动,同时具有多种调节功能,既可以作用于免疫细胞,也可直接作用于肿瘤细胞,发挥了复杂的生物学作用。CXC趋化因子受体3(CXC chemokine receptor 3,CXCR3)通过与其同源CXC趋化因子配体9(CXC chemokine ligand 9,CXCL9)/10/11结合,不仅参与了肿瘤发生、侵袭并促进肿瘤相关血管的形成,同时也介导了免疫细胞向肿瘤组织中浸润,为无免疫反应性或免疫反应性差的"冷肿瘤"转变为免疫反应性的"热肿瘤"提供了新的思路,并且可能成为治疗的新靶点。这种抗肿瘤和促肿瘤的双重作用,似乎与CXCR3变体(CXCR3-A、CXCR3-B)发挥相反的作用密切相关。本文就近年来CXCR3变体CXCR3-A、CXCR3-B及其配体CXCL9/10/11在TME中作用的研究进展展开综述。

重症肌无力患者血清IL-9、IL-15、Titin-Ab、AchR-Ab水平检测及临床意义

目的探讨重症肌无力(MG)患者血清白细胞介素(IL)-9、IL-15、连接素抗体(Titin-Ab)、乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)水平检测及临床意义。方法将该院2016年2月至2019年8月收治的42例MG患者设为观察组,选取该院同期体检健康者42例作为对照组。使用酶联免疫分析法检测所有研究对象的血清IL-9、IL-15、Titin-Ab、AchR-Ab水平,并进行对比分析。结果观察组患者血清IL-9、IL-15、Titin-Ab、AchRAb水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。眼睑型组患者血清IL-9、IL-15水平虽低于全身型组患者,但差异无统计学意义(P>0.05);眼睑型组患者血清Titin-Ab、AchR-Ab水平均低于全身型组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。胸腺疾病组患者血清IL-9、IL-15水平较非胸腺疾病组患者高,但差异无统计学意义(P>0.05);胸腺疾病组患者血清Titin-Ab、AchR-Ab水平均高于非胸腺疾病组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MG患者血清IL-9、IL-15、Titin-Ab、AchR-Ab水平均较高,可作为诊断MG的灵敏指标,其中血清Titin-Ab、AchR-Ab水平对鉴别患者是否合并胸腺疾病、是否为全身型MG具有重要意义。

重症肌无力患者外周血中Th9细胞表达及其临床意义

目的探讨重症肌无力患者外周血中T辅助细胞9(Th9)频率变化及意义。方法选取2014年1月—2017年6月于笔者所在医院就诊且被明确诊断的MG患者31例,同时选取年龄和性别构成比相匹配的健康体检者30例作为对照组。采集静脉血,流式细胞术检测外周血Th9细胞比例,ELISA检测血清IL-9水平,放免法检测anti-AChR水平,Spearman分析各指标间的相关性。结果 Th9细胞比例和血清IL-9水平在MG患者中均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。此外,MG患者外周血Th9细胞比例与血清IL-9水平和anti-AchR均呈显著正相关关系,且IL-9与Anti-AchR间也呈现正相关性。结论 Th9细胞和IL-9在GM患者中表达上调,可能参与了MG的发病过程。

基于CRISPR/Cas9系统Ⅰ型干扰素受体亚单位1基因敲除的Caco-2细胞系的构建

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palinmic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9)系统在人结肠腺癌细胞Caco-2中敲除Ⅰ型干扰素受体亚单位1(interferon alpha/beta receptor subunit 1,IFNAR1)基因,构建IFNAR1基因敲除Caco-2细胞系。方法利用CRISPR/Cas9技术设计特异性识别IFNAR1基因外显子区的sgRNA(single guide RNA)序列,构建LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA重组质粒,慢病毒包装后感染Caco-2细胞,嘌呤霉素抗性筛选,有限稀释法培养单克隆细胞系。通过靶基因测序和Western blot法验证IFNAR1基因敲除情况;通过加入外源性IFNβ检测IFNAR1基因敲除细胞CXC趋化因子配体10(CXC chemokine ligand 10,CXCL10)和干扰素刺激基因20(interferon-stimulatd gene 20,ISG20)mRNA水平。结果质粒LentiCRISPRv2-IFNAR1-sgRNA测序结果显示插入位置均位于BsmBⅠ酶切黏性末端。共获得2株IFNAR1基因敲除单克隆细胞株,测序结果显示Caco-2-IFNAR1-KO1的IFNAR1第6个外显子发生5 bp缺失,Caco-2-IFNAR1-KO2的第7个外显子发生18 bp缺失,同时有1 bp增加。与野生型Caco-2细胞相比,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞IFNAR1蛋白未见表达。相比于0 ng/mL IFNβ,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为0.566和1.268,P>0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为1.522和1.733,P>0.05)均无明显升高;与野生型Caco-2细胞相比,在50 ng/mL外源IFNβ刺激下,Caco-2-IFNAR1-KO1和Caco-2-IFNAR1-KO2细胞CXCL10基因mRNA水平(t分别为6.763和6.777,P<0.05)和ISG20基因mRNA水平(t分别为5.664和5.653,P<0.05)均显著降低。结论利用CRISPR/Cas9技术成功获得了IFNAR1基因敲除的Caco-2细胞株,该细胞系依赖Ⅰ型IFN受体(interferon alpha/beta receptor,IFNAR)激活的下游分子被明显抑制,为进一步探讨病毒感染Caco-2细胞后的天然免疫反应及复制包装机制提供了有力的工具。

α-芋螺毒素MIA和MIB特异性阻断肌肉型乙酰胆碱受体研究

α-芋螺毒素是从海洋软体动物芋螺毒液中发现的多肽类毒素,能够特异作用于各种不同亚型烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs在调节神经递质释放、细胞兴奋性等方面发挥重要生理功能。因为nAChRs功能异常与多种疾病密切相关,所以α-芋螺毒素可以开发为研究nAChRs的分子探针或直接作为先导药物进行开发。前期,研究人员从幻芋螺中发现的4种α-3/5型芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,但MIA和MIB对不同亚型的nAChRs阻断活性及选择性还没有深入研究,本研究通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相法合成了α-芋螺毒素MI、MIA、MIB和MIC,并利用电生理技术对它们抑制不同亚型鼠源nAChRs的活性进行系统测定,结果表明MIA和MIB是肌肉型乙酰胆碱受体拮抗剂,半阻断剂量(IC_(50))分别是14.45和72.78 nmol·L^(-1),稍弱于MI与MIC,且对其他神经型nAChRs阻断活性微弱。分子对接研究显示, MIA和MIB与肌肉型nAChRs作用机制类似, N-端氨基酸序列差异是其活性差异的主要原因。本研究表明,芋螺毒素MIA和MIB有潜力发展成为检测肌肉型nAChRs功能以及诊断或治疗相关疾病的工具药物。

多发性硬化患者外周血单个核细胞Toll样受体9的表达及血清白介素-10水平的研究

目的研究Toll样受体9(TLR-9)在多发性硬化(MS)患者外周血单个核细胞(PBMCs)上的表达水平及MS患者血清白介素-10(IL-10)水平,探讨其潜在的机制。方法分离23例活动期、19例缓解期MS患者及20例正常对照组PBMCs,用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PBMCs中TLR-9mRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验法检测其血清白介素-10水平。结果活动期MS患者PBMCs的TLR-9mRNA表达水平高于缓解组(P<0.01)及正常对照组(P<0.01),缓解期和正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。MS缓解期患者血清IL-10水平显著高于活动期患者(P<0.01),活动期和缓解期的患者均高于正常对照组(P<0.01)。TLR-9mRNA表达水平与血清IL-10水平呈负相关(r=-0.224,p=0.013)。结论活动期MS患者PBMCs的TLR-9mRNA的表达水平增高,并且与MS患者血清IL-10水平呈负相关,TLR9在MS免疫发病机制中具有重要的作用,在MS中IL-10是一种保护性抑炎因子,可能有利于疾病的缓解。