KGF-transfected cells can stimulate growth and proliferation of human cultured keratinocytes in vitro

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含转表皮细胞生长因子基因人表皮细胞复合皮的构建与移植

目的探讨转染表皮细胞生长因子(EGF)基因的人表皮细胞移植后EGF的表达及对细胞增殖的影响。方法将Balb/c小鼠的表皮细胞和转染EGF基因的人表皮细胞按1∶1、1∶3、1∶5的比例混合,种植于脱细胞真皮替代物表面,于体外培养后形成复合皮,将复合皮移植于Balb/c小鼠全层皮肤缺损创面,抗EGF抗体免疫组织化学染色观察移植后EGF的表达,抗增殖性细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色观察表皮细胞的增殖情况。结果小鼠表皮细胞与转EGF基因的人表皮细胞按1∶5混合构建的复合皮移植后1～2周,抗EGF染色阳性,1周时,新生表皮基底层中PCNA阳性细胞比含单纯小鼠表皮细胞的复合皮移植后显著增多(P<0.01)。结论转染EGF基因的人表皮细胞在移植后早期可表达外源基因产物,并促进表皮细胞增殖。

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

摘要：目的应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）基因重组腺病毒。方法将β-gal基因克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack—CMV上，在BJ5183大肠杆菌内与pAdEasyl骨架质粒完成同源重组；经脂质体介导转入HEK293细胞包装、扩增并经反复乒乓感染获得携带β-gal基因的重组腺病毒Ad—β-gal；有限稀释法检测病毒滴度；X—gal组织化学染色检测重组腺病毒Ad—β-gal在HEK293细胞中的功能。结果成功构建携带β-gal基因的重组腺病毒Ad—β-gal，病毒滴度达（2．5～4．0）×10^11EFU／ml；感染复数（multiplicity of infection，MOI）为10时对HEK293细胞48h转染率达70％，并在X—gal试剂作用下，细胞呈现蓝色。结论成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒，能高效感染293细胞，并功能性表达β-半乳糖苷酶。

腺病毒介导基因转染活体眼组织的研究

目的 :了解活体内不同途径应用腺病毒转染外源基因在眼组织的分布情况 .方法 :将含有 β 半乳糖苷酶 (beta galactosidase,β gal)报告基因的腺病毒 ,在 1× 10 9～ 1× 10 11nfu·L-1的滴度下 ,分别采用玻璃体腔内注射、前房注射、表面点药及球旁注射到大鼠眼内 ,3d ,1,2 ,3和 4wk后用 β gal染色法观察 β gal基因在眼组织内的分布情况 .结果 :各病毒滴度组均可有效地转染外源基因 ,且未观察到细胞病理改变 .玻璃体腔内注射的大鼠眼球组织包括角膜、虹膜、睫状体、视网膜均有β gal基因表达 ,前房注射组角膜、虹膜、睫状体有表达 ,表面点药组仅有角膜上皮细胞表达 ,球旁注射组眼外肌有表达 .注射 3d后开始出现 β gal基因阳性表达 ,持续达 4wk以上 .结论 :腺病毒能有效、稳定地转染外源基因到活体眼组织的角膜、虹膜、睫状体。

hEGF cDNA导入培养的人角朊细胞及其表达

目的 观察外源性人表皮细胞生长因子 ( h EGF)基因导入正常角朊细胞后 ,能否表达及分泌 h EGF;为深入探讨h EGF的作用机制及临床应用奠定物质基础 .方法 脂质体包埋 h EGF c DNA的真核表达质粒 pc DNA3- h EGF转染人角朊细胞 ,经 G418筛选、克隆、扩大及传代培养转基因的角朊细胞 .特异性 neo探针原位杂交显示转基因细胞内的质粒载体 ;h EGF抗体免疫细胞化学法观察转基因细胞内 h EGF的表达 ;采用放射免疫分析测定细胞向胞外分泌 h EGF的情况 .结果 pc DNA3- h EGF可经脂质体介导有效地转染角朊细胞 ;G418筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒 ,胞质内有阳性 h EGF表达 ;并向胞外分泌 h EGF.结论 由真核表达质粒 pc DNA3- h EGF转染人角朊细胞获得的含外源性 h EGF基因的角朊细胞具有表达分泌 h

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在_及GRC细胞株中的表达

目的 :研究阳离子脂质体Lipofectin介导的 β 半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。 方法 :质粒pDCβ在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取 ,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析 ,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2 、人肾癌细胞株GRC ,然后用X gal细胞化学染色法检测 β 半乳糖苷酶活性。 结果 :β 半乳糖苷酶活性在HepG2 、GRC中均有表达。结论

脂质体介导质粒转染角朊细胞的影响因素

探讨利用脂质体介导真核表达质粒转染体外培养的人角朊细胞的最佳转染条件。体外分离培养正常人角朊细胞 ,培养至 6 0 %、70 %、80 %、90 %及 10 0 %融合时 ,应用不同浓度的LipofectAMINE包被真核表达质粒pCMV·SPORT β gal,分别转染 6、8、10、12及 2 4h。细胞经转染后再培养 48h ,行 β 半乳糖苷酶原位染色 ,镜下观察并计算阳性转染率。被转染的阳性细胞 ,可见质粒 β 半乳糖苷酶基因的良好表达 ;当细胞融合率为 80 %、90 % ,以12 5 μL/ 10 0 μL的LipofectAMINE包被 1 5 μg/ 10 0 μL的pCMV·SPORT β gal,转染时间为 8h的转染率最高 ,可分别达到 (31 35± 1 35 ) %、(32 32± 2 4) %。该实验说明LipofectAMINE可有效地介导真核表达质粒转染培养的人角朊细胞 ;转染率与细胞生长状态、脂质体包被质粒的浓度比例、及转染时间直接相关。

β-半乳糖苷酶基因转染角质形成细胞的瞬时表达检测

为了解角质形成细胞作靶细胞进行基因转染、基因表达的可行性，用ｐＳＬＸＣＭＶβｇａｌ转染原代皮肤角质形成细胞，并观察其瞬时表达情况，发现转染后３６小时细胞即可表达β半乳糖苷酶（βｇａｌ），表现为细胞蓝染，４８小时蓝染细胞最多，约占总细胞数的１５％。提示外源基因能够在角质形成细胞中有效地表达。

外源性hbFGF cDNA 导入人角朊细胞及其表达

目的：观察外源性人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因导入正常角朊细胞后，能否表达及分泌ｈｂＦＧＦ，并探讨其机理；为开展临床创面基因治疗提供实验依据和奠定物质基础．方法：采用脂质体包埋ｈｂＦＧＦｃＤＮＡ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ转染培养的人角朊细胞，经Ｇ４１８筛选、克隆、扩大及传代培养含转基因的角朊细胞．用特异性ｎｅｏ探针原位杂交显示转基因角朊细胞内含有拟转入的ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ质粒载体；抗ｈｂＦＧＦ抗体免疫细胞化学法观察转基因角朊细胞内ｈｂＦＧＦ的翻译表达；选择人真皮成纤维细胞为效应细胞，应用抗体中和法分析转基因角朊细胞分泌ｈｂＦＧＦ活性物质所引起的成纤维细胞增殖效应，了解ｈｂＦＧＦ向胞外分泌情况．结果：ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ可经脂质体介导有效地转入靶细胞角朊细胞内；用Ｇ４１８筛选纯化转基因后的角朊细胞内含转入的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｈｂＦＧＦ，胞浆内有阳性ｈｂＦＧＦ表达，并向胞外分泌ｈｂＦＧＦ活性物质，刺激真皮成纤维细胞增殖．结论：含外源性ｈｂＦＧＦ基因的角朊细胞可于体外纯化及扩大培养。

外源基因在蛙神经元中的表达

含 β 半乳糖苷酶基因的真核表达载体DNA ,直接注射到视神经切断或正常的黑斑蛙的视网膜中 .注射 2周后 ,观察到蛙视网膜神经细胞仍然有转染基因表达 ,这种基因转染对神经元的类型没有选择性 .被转染神经元主要局限于注射点周围 .蛙视神经切断后 。

反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响

目的：以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因（hTRT）转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响。方法：将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性。结果：获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8~9代。结论：转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因。

β－半乳糖苷酶基因在HeLa细胞中瞬时表达的动态研究

本文研究了由ＳＶ４０早期启动子和增强子启动的β－半乳糖苷酶基因在ＨｅＬａ细胞瞬时表达的动态情况．外源β－半乳糖苷酶基因经磷酸钙方法导入受体细胞５０ｈ后其酶活性为６０ｍｉｌｌｉｕｎｉｔｓ，该酶活性维持一段时间后呈下降趋势，经转染２７０ｈ后，该酶活性降为０．此外本文结果还表明，携带有β－半乳糖苷酶基因的质粒对受体细胞ＨｅＬａ具有较高的转染效率．

聚乙烯亚胺负载基因和蛋白质共递送实验

通过构建载体/基因/蛋白共递送复合体系,探讨了阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI,25 kDa)负载基因和蛋白在细胞中共递送的效率。实验采用凝胶阻滞电泳确定了聚乙烯亚胺与蛋白、基因形成稳定复合物的最佳质量比为2∶1∶0.05。激光扫描共聚焦成像结果表明,聚乙烯亚胺可以有效递送Cy5-pDNA和FITC-BSA进入细胞。通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)原位染色法、Western blot和Caspase-3活性检测实验,进一步分析了递送蛋白β-Gal的活性和p53基因的转录翻译功能。结果显示,PEI介导递送的β-Gal保持了较高的酶活性,可以有效催化底物的分解。共负载p53基因转染细胞后,p53蛋白表达水平显著上调且可以激活p53蛋白相关信号通路中关键性激酶Caspase-3。

人角质形成细胞基因导入效率的影响因素研究

目的了解不同大小质粒和不同基因转染法对人KC基因导入效率的影响。方法采用脂质体转染法、阳离子多聚物转染法、电穿孔联合细胞核转染试剂转染法、慢病毒感染法，分别将不同大小的质粒[pSUPER-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、pEGFP—N2、pHSER-绿色荧光蛋白（GFP）、ploxP-EGFP]导入人永生化KC株HaCaT细胞和人胚肾细胞株293FT细胞（后者为对照）。于倒置荧光显微镜下观察GFP的表达，计算转染率。结果（1）采用脂质体转染法可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率1．0％～3．3％）及293FT细胞（转染率80．0％～84．7％）。（2）阳离子多聚物转染法亦可将4种质粒导入HaCaT细胞（转染率为1．0％～3．7％）和293FT细胞（转染率81．3％～86．7％）。（3）采用电穿孔联合细胞核转染试剂转染法，可以将2种较小片段质粒pSUPER—EGFP和pEGFP-N2导入HaCaT细胞，转染率分别为22．3％和19．0％；而2种较大片段质粒pHSER-GFP和ploxP-EGFP的转染率分别为4．0％和3．3％。（4）pHSER-GFP经慢病毒包装后，导入HaCaT细胞的转染率高达97．0％，明显优于前3种转染法。结论脂质体转染法、阳离子多聚物转染法较难将外源性基因导入人KC，慢病毒感染法的转染率明显优于电穿孔联合细胞核转染试剂转染法；