人β地中海贫血β^41/42突变基因的克隆和真核表达体系的构建

目的:克隆人地中海贫血基因β41/42及调控系列LCR,构建该致病基因的体外真核表达体系,为该病基因治疗的研究提供理想模型。方法:抽提β41/42纯合子患者的DNA,PCR扩增出人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β41/42基因,将其串连克隆至真核稳定表达质粒pcDNA3.1-中,脂质体转染至小鼠红白血病细胞(MEL),DMSO诱导MEL细胞表达,逆转录PCR检测人β41/42基因在MEL中的表达。结果:成功构建了人β41/42突变基因的真核表达系统。结论:β41/42基因在MEL细胞中的表达情况与设计的表达完全一致,为该病的基因治疗研究提供了一个理想模型。

人β地中海贫血突变基因重组载体pcDNA3.1-LCR-β^(41/42)的构建

目的构建人β地中海贫血突变基因β41 /42及具有调控功能的基因座控制区(LCR)重组载体,为该病基因治疗的体外细胞模型和转基因小鼠模型的建立奠定基础。方法抽提β41 /42纯合子患者的DNA,PCR扩增人β珠蛋白基因座控制区 (LCR)和β41 /42基因,将其串联克隆至pcDNA3. 1 中,酶切及测序鉴定重组载体。结果所构建的重组载体中含人β珠蛋白基因座控制区(LCR)和β41 /42基因,测序结果及引入方向正确。结论成功构建了含 5. 5kgβ珠蛋白基因座控制区(LCR)的β41 /42人重型地中海贫血基因的重组载体。

CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42的构建及其稳定转染HeLa细胞模型的建立

目的:构建CD41-42突变型β地中海贫血重组载体pEGFP-C2-CD41-42和HeLaCD41-42细胞模型,为β地中海贫血CD41-42突变型细胞、小鼠模型建立及进一步基因治疗提供依据。方法:在β地中海贫血CD41-42突变的纯合子患者外周血中提取DNA,PCR法扩增含有βCD41-42的β-珠蛋白基因片段。将PCR产物βCD41-42珠蛋白基因克隆到pEGFP-C2载体中,用脂质体2000将pEGFP-C2-βCD41-42质粒转染HeLa细胞,观察转染后βCD41-42在HeLa细胞中荧光表达情况。RT-PCR法检测βCD41-42在HeLa细胞中的表达。结果:重组质粒pEGFP-C2-βCD41-42转染HeLa细胞24h后细胞发出绿色荧光,G418筛选后,有大量荧光表达。RT-PCR扩增得到227bp的特异性条带,而稳定转染pEGFP-C2空质粒的HeLa细胞中不表达特异性条带。结论:成功构建β地中海贫血pEGFP-C2-βCD41-42突变基因重组载体,并成功构建HeLaCD41-42细胞模型。

人β地中海贫血β^(41-42(-CTTT))转基因小鼠的构建

目的建立可表达人类βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠。方法采用Gateway技术,将人类βCD41-42(-CTTT)基因克隆到真核表达载体p RP.Des2d-EF1A中,重组质粒通过PCR技术和测序方法进行验证。采用显微注射法将线性化的重组质粒注射至FVB小鼠受精卵的雄性原核中,然后将受精卵植入假孕母鼠的子宫。采用PCR技术筛选出整合了外源基因的小鼠,实时荧光定量PCR验证βCD41-42(-CTTT)基因的表达。结果成功构建了真核表达载体p RP.Des2dEF1A-βCD41-42(-CTTT)。在出生的24只新生鼠中,共获得5只阳性转基因首建小鼠。结论建立了人βCD41-42(-CTTT)基因的转基因小鼠模型,为β地贫的基因治疗研究奠定了基础。

β-地中海贫血CD41-42型突变基因重组载体的构建

目的:构建β-地中海贫血CD41-42突变基因和基因调控区HS2、HS3全基因片段的真核表达重组载体,为β-地中海贫血CD41-42突变基因治疗的细胞模型奠定基础。方法:设计合成β-地中海贫血CD41-42突变纯合子患者的DNA特异性引物,扩增基因座控制区(LCR)和CD41-42突变基因,插入载体pcDNA3.1-中,筛选阳性重组体,通过酶切分析及PCR进行鉴定。结果:扩增出2.1 kb CD41-42突变基因及5.5 kb LCR片段,酶切及测序结果证明重组载体构建成功,测序结果和引入方向正确。结论:成功构建了含人β-地中海贫血CD41-42基因的重组载体。

人β-地中海贫血CD41-42型突变基因慢病毒载体的构建和293T的转染

目的:构建介导人β-地中海贫血CD41-42突变基因为目的基因的慢病毒载体,为基因治疗的细胞模型和转基因小鼠的建立提供基础。方法:抽提β-地中海贫血CD41-42突变纯合子患者的DNA,设计合成相应特异性引物,PCR扩增CD41-42突变基因,加上SphI和NotI两个酶切位点进行T载体克隆,通过筛选获得重组质粒。用限制性内切酶将目的基因片段和LV5慢病毒载体连接,转入感受态细胞,筛选获得慢病毒表达载体LV5-βCD41-42,并进行测序。将慢病毒载体转染293T细胞,包装病毒,测定病毒浓度。结果:通过PCR获得长度为2128bp带有SphI和NotI序列的目的基因。pUC57载体和慢病毒表达载体LV5连接,慢病毒表达载体LV5-βCD41-42构建成功,序列正确。结论:成功构建并包装含β-地中海贫血CD41-42突变基因的人慢病毒。