敲除β珠蛋白β^(maj)及β^(min)基因的C129小鼠ES-D3细胞系建立

目的通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因打靶载体,建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因ES-D3细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。方法根据C129系小鼠β珠蛋白基因分子结构基础,用基因克隆方法在βmaj和及βmin两个同源序列两侧分别将1.7kb和7.0kb的片段插入pNTK质粒中,构建置换型打靶载体β-pNTK,用新霉素抗性基因(Neo)和单疱病毒腺苷激酶(TK)抗性基因作为正负筛选标记。用SalⅠ酶切将打靶载体β-pNTK线性化,采用电穿孔法在ES-D3细胞水平进行打靶,通过G418和GAN进行正负筛选,获得生长良好的胚胎干细胞克隆;用PCR和Southern印迹杂交方法鉴定阳性克隆基因组DNA整合结果,用碱性磷酸酶实验、体外胚体形成实验以及畸胎瘤成瘤实验鉴定细胞生物学特性。结果构建了C129系小鼠置换型打靶载体,经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamHⅠ及EcoRⅠ酶切及部分测序分析,所插入方向正确,结构合理,达到所预期的目的;获得了8个阳性克隆珠,阳性克隆细胞株经PCR和South-ern印迹杂交方法鉴定外源基因整合到ES细胞基因组DNA中;经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性。结论构建了C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj及βmin基因置换型打靶载体;该载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后,获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin基因的胚胎干细胞系,为制作基因敲除嵌合体小鼠奠定了基础。