神经肽Y/Y1受体激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤

目的:研究神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)/Y1受体信号转导在心肌细胞损伤中的作用及机制。方法:C57BL/6J小鼠皮下注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)构建心肌损伤模型,腹腔注射Y1受体特异性拮抗剂BIBO3304干预。小鼠随机分为对照组(生理盐水)、ISO组[20 mg/(kg·d)ISO]、BIBO3304+ISO组[0.1 mg/(kg·d)BIBO3304+20 mg/(kg·d)ISO]、BIBO3304组[0.1 mg/(kg·d)BIBO3304],每组10只,连续给药14 d。实时定量PCR和Western blot检测小鼠心肌组织中NPY表达。HE染色和Masson染色观察各组小鼠心肌纤维结构变化和纤维化程度;定量PCR检测小鼠心肌肥大基因心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、β⁃肌球蛋白重链(β⁃myosin heavy chain,β⁃MHC)mRNA表达。采用Y1受体特异性激活剂[Leu31,Pro34]⁃NPY刺激H9C2细胞,检测ANP、β⁃MHC mRNA表达;CCK⁃8检测心肌细胞活力。Western blot检测各组小鼠心肌组织和H9C2细胞中activeβ⁃catenin、磷酸化糖原合成酶激酶⁃3β(phospho⁃glycogen synthesis kinase 3β,p⁃GSK3β)、总糖原合成酶激酶⁃3β(total glyco⁃gen synthesis kinase 3β,t⁃GSK3β)蛋白表达。免疫荧光染色检测心肌细胞β⁃catenin入核情况。利用β⁃catenin特异性抑制剂ICG001处理细胞,检测[Leu31,Pro34]⁃NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力变化。结果:与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织NPY mRNA和蛋白表达均显著增加(P<0.05),心肌纤维排列紊乱,心肌纤维化程度高,心肌肥大基因表达增加。与ISO组比较,BIBO3304+ISO组小鼠心肌损伤和纤维化得到有效缓解,心肌肥大基因表达下降(P<0.01)。与对照组比较,[Leu31,Pro34]⁃NPY增加H9C2细胞ANP、β⁃MHC mRNA表达,降低心肌细胞活力(P<0.01)。与对照组比较,ISO组小鼠心肌组织activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达明显上调,p⁃GSK3β/t⁃GSK3β增加;与ISO组比较,BIBO3304+ISO组心肌组织activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达降低(P<0.05)。与对照组比较,[Leu31,Pro34]⁃NPY显著增加心肌细胞activeβ⁃catenin、p⁃GSK3β表达(P<0.05),促进细胞核β⁃catenin积累。与[Leu31,Pro34]⁃NPY组比较,BIBO3304抑制细胞核β⁃catenin表达,ICG001显著缓解[Leu31,Pro34]⁃NPY诱导的心肌细胞肥大和细胞活力下降(P<0.01)。结论:NPY通过Y1受体转导激活β⁃catenin信号通路介导心肌细胞损伤和心肌纤维化。

应力刺激通过Wnt/β⁃catenin通路调控牙骨质细胞的矿化

目的牙骨质再矿化对牙根吸收后牙骨质修复至关重要,本文探究应力下Wnt/β⁃catenin通路对牙骨质细胞矿化的调控机制。方法对矿化诱导21 d的牙骨质细胞系IDG⁃CM6细胞加载轻力6 h,通过茜素红染色观察IDG⁃CM6细胞矿化程度,通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT⁃qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)及免疫荧光检测β⁃catenin及Runx2、Osterix的表达水平。采用生信技术筛选差异表达基因后,通过敲除IDG⁃CM6细胞内β⁃catenin检测矿化程度及Runx2、Osterix表达水平变化。结果应力下,IDG⁃CM6细胞矿化增加,Runx2、Osterix表达水平升高;生信分析及RT⁃qPCR、Western blot、免疫荧光染色表明应力促进β⁃catenin的表达,下调β⁃catenin能逆转应力刺激下的矿化效应。结论应力条件下,Wnt/β⁃catenin通路参与了牙骨质矿化的调控,可能是牙根吸收后牙骨质修复的关键通路。

慢性肺源性心脏病患者血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA表达水平与病情严重程度及预后的关系

目的分析慢性肺源性心脏病(CPHD)患者血清中糖原合成酶激酶⁃3β(GSK⁃3β)、β⁃连环蛋白(β⁃catenin)信使RNA(mRNA)表达水平与病情严重程度及预后的关系。方法选取2020年1月—2021年10月汉中市三二〇一医院收治的CPHD患者108例作为CPHD组,根据肺心功能分为失代偿亚组40例、代偿亚组68例,根据患者1年内生存情况分为存活亚组85例、死亡亚组23例。以同期健康体检者108例为健康对照组。收集CPHD患者的基本资料,荧光定量PCR法检测受试者血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA表达水平;比较各组血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA表达水平差异;Pearson法分析CPHD患者血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA表达水平的相关性,多因素Cox回归分析影响CPHD患者死亡的危险因素,受试者工作特征曲线(ROC)分析血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA表达水平对CPHD患者死亡的预测价值。结果与健康对照组比较,CPHD组血清GSK⁃3βmRNA表达水平显著降低,β⁃catenin mRNA表达水平显著升高(t/P=28.208/<0.001、25.981/<0.001);与代偿亚组比较,失代偿亚组血清GSK⁃3βmRNA表达水平显著降低,β⁃catenin mRNA表达水平显著升高(t/P=12.572/<0.001、12.156/<0.001);与存活亚组比较,死亡亚组吸烟史比例、PaCO_(2)、β⁃catenin mRNA表达水平显著升高,PaO_(2)、GSK⁃3βmRNA表达水平显著降低[χ^(2)(t)/P=5.941/0.015、3.690/<0.001、7.353/<0.001、2.723/0.008、5.730/<0.001];CPHD患者血清GSK⁃3βmRNA与β⁃catenin mRNA表达水平呈负相关(r/P=-0.502/<0.001);GSK⁃3βmRNA高表达是CPHD患者死亡的保护因素[HR(95%CI)=0.843(0.728~0.976)],β⁃catenin mRNA高表达是其危险因素[HR(95%CI)=1.391(1.041~1.859)];血清GSK⁃3β、β⁃catenin mRNA及二者联合预测CPHD患者死亡的曲线下面积分别为0.838、0.884、0.913,均有较好的预测价值。结论CPHD患者血清GSK⁃3βmRNA呈低表达,β⁃catenin mRNA呈高表达,二者与病情严重程度及预后相关,且对患者预后有较高预测效能。

SFRP1/Wnt/β⁃catenin通路在宫颈癌干细胞中的作用

目的探讨宫颈癌干细胞中的SFRP1/Wnt/β⁃catenin通路的作用。方法运用流式分选宫颈癌SiHa细胞中的侧群干细胞(side population cell,SP)及非侧群干细胞(non side population cell,NSP);体内外功能实验验证SP及NSP细胞之间的增殖、克隆形成、成球及皮下成瘤能力差异,免疫印迹实验检测干性标志物(CD133、CD44、Nanog);经放化疗处理后,检测细胞增殖、克隆形成能力;免疫印迹实验检测分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)、Wnt/β⁃catenin通路蛋白,免疫荧光检测β⁃catenin的表达情况,酶联免疫吸附实验检测SFRP1分泌情况。结果SP细胞的增殖、克隆形成、成球及皮下成瘤能力明显强于NSP细胞,SP细胞的干性标志物水平明显高于NSP细胞;经过放化疗处理后,SP细胞的增殖、克隆形成能力明显强于NSP细胞;SP细胞中的SFRP1表达明显高于NSP细胞,分泌SFRP1的浓度明显低于NSP细胞,SP细胞中Wnt/β⁃catenin通路激活且β⁃catenin在胞核有明显表达。结论宫颈癌干细胞可能通过减少SFRP1的分泌来激活Wnt/β⁃catenin通路,从而促进其增殖、克隆及皮下成瘤能力,并增强其放化疗抵抗能力。

沉默TIPE基因下调Wnt/β⁃catenin信号对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响

目的研究沉默TIPE(tumor necrosis factor⁃α⁃induced protein 8,TNFAIP8)基因下调Wnt/β⁃catenin信号对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法通过构建shRNA⁃TIPE慢病毒载体转染人非小细胞肺癌细胞系A549,利用Real time PCR、Western blot检测A549内TIPE、β⁃catenin的表达水平,细胞克隆形成实验、CCK8检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果shRNA⁃TIPE慢病毒转染非小细胞肺癌细胞系A549后:(1)TIPE和β⁃catenin的mRNA、蛋白表达水平均低于阴性对照组和空白对照组;(2)TIPE基因沉默后,A549细胞克隆形成能力显著下降(F=17.48,P=0.0003),生长曲线实验检测A549细胞增殖能力下降;(3)shRNA⁃TIPE慢病毒转染后,A549细胞凋亡率(18.4±4.5)%明显高于阴性对照(12.7±3.6)%和空白对照组(11.5±3.4)%,差异有统计学意义(F=4.4844,P=0.0351)。结论TIPE可能通过激活Wnt/β⁃catenin信号通路促进非小细胞肺癌细胞系A549细胞增殖,抑制凋亡。

同源域蛋白同源盒基因通过调控Wnt/β⁃catenin信号通路抑制胃癌细胞的增殖

目的探讨同源域蛋白同源盒基因(HOPX)在胃癌中的表达情况及调控胃癌细胞的增殖能力及其作用机制。方法采用Real time⁃PCR及Western blot检测HOPX在胃癌细胞和组织中的mRNA及蛋白表达水平;在胃癌细胞HGC27及BGC823中稳定过表达HOPX基因,通过CCK⁃8法、克隆形成实验、EdU法检测HOPX对胃癌细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测HOPX对胃癌细胞细胞周期的调控作用。另外将用于检测β⁃catenin/TCF/LEF可转录活性的荧光素酶报告质粒TOP flash和FOP flash转染胃癌细胞,使用双荧光素酶报告系统测定过表达HOPX对细胞内荧光素酶转录活性的影响。此外采用Western blot分别测定过表达HOPX对胃癌细胞内β⁃catenin、GSK⁃3β及p⁃GSK⁃3β蛋白表达水平的变化。进一步检测过表达HOPX后,胃癌细胞核内β⁃catenin蛋白表达水平及其下游靶基因CyclinD1的表达变化,以探讨HOPX影响胃癌细胞增殖的具体机制。结果Real time⁃PCR及Western blot结果显示HOPX在胃癌中的mRNA及蛋白表达水平均显著降低,HOPX过表达后可显著抑制胃癌细胞的增殖并抑制其细胞周期。Western blot结果表明过表达HOPX可通过抑制GSK3β的磷酸化水平促进β⁃catenin的降解,从而抑制β⁃catenin入核,进而下调下游靶基因CyclinD1的表达,达到抑制胃癌细胞的增殖能力。结论HOPX通过调控Wnt/β⁃catenin信号通路以抑制胃癌细胞的增殖。

CT灌注参数与胃癌临床病理特征及Wnt/β⁃catenin通路介导血管新生的关系

目的研究CT灌注参数与胃癌临床病理特征及Wnt/β⁃catenin通路介导血管新生的关系。方法选择2018年1月至2020年12月在中国人民解放军陆军第七十三集团军医院经病理诊断的胃癌患者作为研究对象,术前进行CT灌注成像检查并测量血流量(BF)及血容量(BV)、达峰时间(TTP)、平均通过时间(MTT);术后收集胃癌组织,检测Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin、bFGF、VEGF的mRNA表达水平及微血管密度(MVD)。结果TNMⅢ期胃癌的CT灌注参数BF、BV均高于TNMⅠ~Ⅱ期胃癌,TTP、MTT低于TNMⅠ~Ⅱ期胃癌,差异有统计学意义(t=5.793、2.668、2.057、4.975,P<0.05);低分化胃癌的CT灌注参数BF、BV均高于中高分化胃癌,TTP、MTT低于中高分化胃癌,差异有统计学意义(t=4.772、2.668、2.231、5.520,P<0.05);胃癌组织的BF、BV与Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin、bFGF、VEGF的mRNA表达水平及MVD水平均呈正相关,TTP、MTT与Wnt1、Wnt3a、β⁃catenin、bFGF、VEGF的mRNA表达水平及MVD水平均呈负相关(P<0.05);胃癌组织BF、BV≥中位数的患者OS率和PFS率低于BF、BV<中位数的患者,TTP、MTT≥中位数的患者OS率和PFS率高于TTP、MTT<中位数的患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃癌CT灌注参数BF、BV、TTP、MTT的变化与TNM分期增加、分化程度降低及生存预后不良有关,Wnt/β⁃catenin通路介导的血管新生与CT灌注参数的变化相关。

慢性肾脏病血管钙化大鼠模型血清中HIF⁃1α、β⁃catenin的表达及意义

目的:建立慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)血管钙化大鼠模型,探讨血清低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、β-连环蛋白(β-catenin)水平与血管钙化的相关性。方法:将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(CON组,10只)和CKD血管钙化组(CKD组,20只),血管钙化组大鼠给予腺嘌呤灌胃及高磷饲料喂养。第6周末收集两组大鼠血、尿液分别检测肾功、钙、磷及24 h尿蛋白定量等;留取肾组织行HE染色;大鼠主动脉行Von Kossa染色及钙含量测定;ELISA法检测血清中HIF-1α、β-catenin水平。结果:与CON组相比,CKD组大鼠24 h尿蛋白定量、血BUN、Scr、P、Ca×P、主动脉钙含量、血清HIF-1α、β-catenin水平均明显增加,血钙降低(P均<0.05);CKD组大鼠见肾小球萎缩、肾小管扩张及肾间质纤维化;主动脉可见明显的钙化结节,Von Kossa染色可见较多黑色物质沉积;血清HIF-1α、β-catenin水平与血P、Ca×P与大鼠主动脉钙含量呈正相关(P均<0.05)。结论:CKD血管钙化时血清HIF-1α、β-catenin水平明显增高,且与主动脉钙化程度明显相关。

MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin水平预测高脂血症急性胰腺炎严重程度及预后

目的探讨肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、E⁃钙黏蛋白(E⁃cadherin)、β⁃连环蛋白(β⁃catenin)水平预测高脂血症急性胰腺炎(HAP)患者严重程度及预后。方法选取内蒙古自治区人民医院2018年6月至2020年6月收治的75例HAP患者(HAP组)与60例同期健康体检者(正常组)。HAP组根据病情严重程度分为轻症组(n=53)与重症组(n=22);以院内治疗期间预后作为标准,存活患者为良好组(n=60),死亡患者为不良组(n=15)。各组均行MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin的相对mRNA表达及C反应蛋白(CRP)、淀粉酶(AMY)、甘油三酯(TG)水平检测。研究外周血MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin与血液指标的相关性,并对MLCK、E⁃cadherin及β⁃catenin表达预测HAP预后的价值进行受试者工作特征曲线(ROC)分析。结果三组外周血MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin相对mRNA表达量及CRP、AMY、TG水平:重度组>轻症组>正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。良好组MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin相对mRNA表达量及CRP、AMY、TG水平显著低于不良组,差异均有统计学意义(P<0.05)。HAP患者MLCK、E⁃cadherin及β⁃catenin分别与CRP、AMY及TG呈正相关(P<0.05)。MLCK敏感性93.33%,特异性86.67%;E⁃cadherin敏感性86.67%,特异性86.67%;β⁃catenin敏感性80.00%,特异性93.33%。结论术前检测HAP患者外周血MLCK、E⁃cadherin、β⁃catenin表达可判断HAP患者病情严重程度,可作为HAP患者预后的预测指标。

下调METTL5通过Wnt/β-catenin信号通路抑制三阴乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭

目的探讨甲基转移酶5(methyltransferase-like 5,METTL5)在三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中的作用和潜在机制。方法采用免疫组织化学方法和Western blot检测TNBC肿瘤组织和细胞系中METTL5的表达情况。用靶向METTL5的shRNA(shRNA-METTL5)转染TNBC细胞后,用CCK-8、集落形成、伤口愈合以及Transwell实验分别检测细胞增殖活性、迁移与侵袭,Western blot检测Wnt/β-catenin信号关键蛋白的表达。构建异种移植瘤模型,验证敲降METTL5对TNBC细胞在体内生长以及Wnt/β-catenin信号活性的影响。结果METTL5在TNBC肿瘤组织和细胞系中表达上调(P<0.01)。敲降METTL5可抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭并降低了Wnt/β-catenin信号分子β-catenin、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-7的表达(均P<0.01)。体内实验显示,敲降METTL5减缓了移植瘤生长和Wnt/β-catenin信号活性。结论敲降METTL5能抑制TNBC细胞的增殖、迁移与侵袭,其作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

补中益气汤协同Siβ-catenin调控Wnt/β-catenin信号通路干预肺腺癌顺铂耐药性的分子机制研究

目的:探讨补中益气汤含药血清协同Siβ-catenin调控Wnt/β-catenin信号通路干预A549/DDP细胞顺铂耐药性的分子机制研究。方法:采用siRNA干扰沉默β-catenin的表达,Western blot检测正常血清组、顺铂组、siCTNNB1-235组、siCTNNB1-510组、siCTNNB1-547组A549/DDP细胞的β-catenin蛋白的相对表达量;干扰β-catenin后,Western blot检测各组A549/DDP细胞β-catenin和Survivin的蛋白表达量,MTT法检测各组A549/DDP细胞对顺铂的IC50,Annexin V/PI染色法检测各组A549/DDP细胞顺铂诱导的凋亡率。结果:相较于正常血清组(1.00),siCTNNB1-235组(0.323±0.021)对β-catenin表达抑制率达67%(P=0.000)。RNAi技术沉默β-catenin后,与正常血清组(1.00)相比,补中益气汤联合顺铂组的Survivin(0.247±0.015)和β-catenin(0.257±0.015)蛋白的表达下调更为明显(P=0.000,P=0.000)。IC50和正常血清组(28.330±1.029)µmol/L相比,单独补中益气汤含药血清(20.350±1.155)µmol/L或单独瞬时转染siCTNNB1-235组(15.577±1.535)µmol/L均可降低A549/DDP细胞顺铂的IC50(P=0.000,P=0.000),2者联合(10.453±0.999)µmol/L使用可进一步降低顺铂的IC50(P=0.000)。与正常血清组(9.130±0.384)%相比,瞬时转染siCTNNB1-235联合顺铂组(64.393±0.244)%和补中益气汤联合顺铂组(70.120±0.400)%的总凋亡率均升高(P=0.000,P=0.000)。结论:补中益气汤含药血清和瞬时转染siβ-catenin在抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肺腺癌顺铂耐药性方面具有协同效应,且补中益气汤具有siβ-catenin瞬时转染样效应。

lncRNA ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路调控肝癌细胞增殖、迁移及侵袭

目的研究一种新的长链非编码RNA ENST00000452996.1对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等的影响及其调控机制。方法TCGA数据集分析肝癌组织ENST00000452996.1表达;构建ENST00000452996.1的shRNA载体,包装病毒感染Huh-7细胞(shENST00000452996.1组),CCK-8法、克隆形成法、流式细胞术、划痕法和Transwell小室法分别检测细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力;Western blot法检测shENST00000452996.1组、ERK激动剂EGF处理组和GSK-3β抑制剂TDZD-8处理组的ERK/GSK-3β/β-catenin信号分子的表达。结果TCGA分析发现,肝癌组织ENST00000452996.1表达水平明显高于癌旁组织,且与Edmondson-Steiner分级呈正相关,与总生存时间呈负相关;与对照组相比,shENST00000452996.1组细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,凋亡能力明显增强,p-ERK1/2、p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin表达均下调,GSK-3β和p-β-catenin表达上调,核β-catenin表达下降;与shENST00000452996.1组相比,EGF处理组p-ERK1/2表达升高,EGF处理组和TDZD-8处理组p-GSK-3β^(Ser9)和β-catenin及核β-catenin表达均升高,GSK-3β和p-β-catenin表达均降低。结论干扰ENST00000452996.1表达抑制ERK1/2磷酸化,阻止GSK3β^(Ser9)磷酸化,导致β-catenin磷酸化,抑制β-catenin核转位,推断ENST00000452996.1通过ERK/GSK-3β/β-catenin信号通路增强肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,从而发挥促进肝细胞癌的作用。

SOX7通过靶向调控SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的研究SOX7调控SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路从而影响结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制。方法将20只裸鼠皮下移植瘤模型随机分为SOX7 NC组(n=5)、SOX mimic组(n=5)、SOX7 NC+PHPS1组(n=5)和SOX7 mimic+PHPS1组(n=5),观察肿瘤生长情况。通过脂质体法将人结直肠癌细胞系SW480细胞转染后,将细胞分为6组,分别为SOX7 NC组、SOX7 mimic组、SOX7 NC+H_(2)O_(2)组、SOX7 mimic+H_(2)O_(2)组、SOX7 NC+PHPS1组、SOX7 mimic+PHPS1组。通过Western blot实验检测各组SW480细胞SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路相关蛋白的表达,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭迁移实验检测SW480细胞的侵袭迁移能力,通过CCK-8检测SW480细胞的增殖。结果小鼠体内实验显示:SOX7 mimic组肿瘤体积明显小于SOX7 NC组(P<0.01),经过PHPS1干预的肿瘤体积明显增大,SOX7 mimic+PHPS1组肿瘤体积和SOX7 NC+PHPS1组的差异无统计学意义。体外实验发现:SOX7 mimic抑制了SW480细胞Wnt、β-catenin、NOX2、NOX4、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达(P<0.01),促进了p-SHP-2蛋白表达(P<0.01);加入H_(2)O_(2)和SHP-2抑制剂后SOX7 mimic组和SOX7 NC组的Wnt、β-catenin、NOX2、NOX4、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义,SHP-2、p-SHP-2蛋白的表达水平降低,但差异无统计学意义;细胞划痕、Transwell侵袭迁移实验和CCK-8实验结果表明SOX7通过氧化应激和SHP-2通路抑制了SW480细胞的迁移、侵袭和增殖(P<0.01)。结论SOX7可通过靶向SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路抑制结直肠癌增殖、侵袭和迁移。

β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响

目的分析β-catenin蛋白在胰腺癌干细胞恶性生物学特性维持过程中的作用及其机制。方法分离培养原代胰腺癌细胞,将胰腺癌细胞分为NC组和ADβ-catenin组,NC组细胞转染阴性空载病毒,ADβ-catenin组细胞转染β-catenin过表达慢病毒载体。采用流式细胞仪分析细胞株肿瘤干细胞表面标志物CD24、CD44及ESA的表达情况;分选出CD24^(+)CD44^(+)ESA^(+)细胞并扩大培养,通过检测分选出细胞的成球能力、克隆形成能力、增殖能力、侵袭迁移能力、细胞周期及凋亡情况;分析β-catenin过表达对胰腺癌干细胞生物学特性的影响。结果ADβ-catenin组细胞中β-catenin mRNA和蛋白的相对表达量显著高于NC组(P=0.016,P=0.015)。流式细胞仪分析结果显示,ADβ-catenin组细胞中CD24^(+)及CD24^(+)CD44^(+)ESA^(+)的细胞率显著高于NC组(P<0.05)。与NC组比较,ADβ-catenin组胰腺癌干细胞克隆形成能力、成球能力、侵袭与迁移细胞数均显著增加(P<0.05)。ADβ-catenin组细胞在24 h、48 h及72 h的光密度(OD)值均显著高于NC组(P<0.05)。与NC组相比,ADβ-catenin组G_(0)/G_(1)期细胞比例显著减少(P<0.05),S期细胞比例增高(P<0.05)。ADβ-catenin组的细胞凋亡率显著低于NC组(P<0.05)。结论β-catenin通过提高胰腺癌原代细胞中CD24^(+)CD44^(+)ESA^(+)的细胞率,促进胰腺癌干细胞成球能力,增强细胞增殖、侵袭与迁移能力,抑制细胞的凋亡,从而维持胰腺癌干细胞的恶性生物学特性。

ADAMDEC1通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的生长和转移

目的:探究敲减解整联蛋白及金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)结构域样癸蛋白1(ADAM domain-like decysin 1,ADAMDEC1)对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:利用GEPIA和UALCAN在线数据库对ADAMDEC1在胰腺癌组织中的表达情况进行分析。Western blot检测人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2和PANC-1)和胰腺导管细胞系(hTERT-HPNE)中ADAMDEC1的蛋白表达水平。采用CCK-8实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞中迁移、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响。此外,通过恢复性实验,检测Wnt/β-catenin信号通路激动剂CHIR-99021对敲减ADAMDEC1抑制胰腺癌细胞生长和转移作用的影响。结果:(1)ADAMDEC1在胰腺癌中高表达;(2)敲减ADAMDEC1表达后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降;(3)敲减ADAMDEC1后,E-cadherin蛋白表达增加,而基质金属蛋白酶9、N-cadherin和vimentin蛋白表达减少,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达亦减少;(4)CHIR-99021与ADAMDEC1小干扰RNA共处理胰腺癌细胞,可逆转敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。结论:ADAMDEC1在胰腺癌中高表达,可通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨吴门骨密葆方含药血清促进间充质干细胞成骨分化的效应机制

目的基于Wnt/β-连环蛋白(β-Catenin)信号通路研究吴门骨密葆方含药血清促进骨髓间充质干细胞成骨分化机制。方法将大鼠骨髓间充质干细胞为正常血清组、经典诱导剂[间充质干细胞成骨诱导分化培养基(OBM)]组、吴门骨密葆方含药血清低(10 g生药/kg)和高剂量(20 g生药/kg)组、抑制剂[分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK-1),0.1 ng·mL-1]组以及吴门骨密葆方含药血清低、高剂量+抑制剂组,成骨诱导分化后干预7 d时采用CCK8法检测细胞活力,随后采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法和ALP试剂盒检测不同剂量吴门骨密葆方含药血清及加入Wnt/β-Catenin信号通路特异性阻滞剂DKK-1干预的间充质干细胞ALP染色强度和活性,Western Blot测定间充质干细胞Wnt信号蛋白家族3alpha(Wnt3a)、β-Catenin、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、破骨细胞抑制因子(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)蛋白表达水平。结果与正常组比较,吴门骨密葆方含药血清干预均可有效促进间充质干细胞增殖(P均<0.05),吴门骨密葆方含药血清可有效促进间充质干细胞ALP染色的强度和活性(P均<0.05),以及调控成骨分化相关的Wnt3a、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白表达(P均<0.05),但是这些调控作用均可被DKK-1在一定程度上逆转。结论吴门骨密葆方含药血清诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化,可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路以及影响OPG/RANKL通路而实现。

低氧微环境通过TGFBI调控Wnt/β-catenin通路介导胰腺癌化疗耐药及机制研究

目的:研究低氧微环境通过TGFBI调控胰腺癌耐药的作用及分子机制。方法:以CCK-8方法检测细胞增殖;以Western blotting技术检测蛋白表达水平;以ImageJ软件分析蛋白灰度值;RNAi技术用于敲减TGFBI基因。结果:TGFBI在Panc-1细胞中表达比正常细胞增强;低氧促进胰腺癌细胞Panc-1增殖并减弱顺铂对Panc-1的抑制作用,而高氧抑制Panc-1细胞增殖并加强顺铂的杀伤作用;低氧促进TGFBI表达及EMT行为;低氧通过TGFBI调控Panc-1细胞增殖及顺铂的杀伤作用;低氧通过TGFBI调控Wnt/β-catenin信号,进而促进EMT行为。结论:低氧微环境通过增强TGFBI表达促进胰腺癌细胞增殖及耐药;低氧微环境通过TGFBI激活Wnt/β-catenin信号通路,促进EMT标志分子表达。

KRT6A介导Wnt/β-catenin信号通路调节上皮-间质转化促进非小细胞肺癌A549细胞抗辐射

目的 探讨KRT6A对非小细胞肺癌A549细胞抗辐射的促进作用,并阐明其作用机制。方法 诱导并建立抗辐射A549(A549-RR)细胞,通过CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术验证细胞构建成功。Western blotting检测A549和A549-RR细胞中KRT6A表达情况。将A549-RR细胞分为敲减对照组(sh-NC组)和敲减KRT6A组(sh-KRT6A组),Western blotting检测KRT6A、上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug)以及β-catenin的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。将A549-RR细胞分为sh-NC组、sh-KRT6A组、敲减KRT6A和过表达对照(shKRT6A+ov-NC组)以及敲减KRT6A和过表达β-catenin (sh-KRT6A+ov-β-catenin组),Western blotting检测β-catenin以及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。结果 成功建立了A549-RR细胞,A549-RR细胞中KRT6A表达上调。敲减KRT6A降低A549-RR细胞增殖活性和克隆形成能力,增加细胞凋亡率,上调E-cadherin蛋白表达并下调N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和β-catenin蛋白表达;过表达β-catenin可逆转此作用。结论 KRT6A在A549-RR细胞中表达上调,敲减KRT6A可降低A549-RR细胞的抗辐射能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路诱导的EMT有关。

山仙颗粒对Hepa1-6肝癌细胞迁移与侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的观察山仙颗粒含药血清对Hepa1-6肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响,并基于上皮-间充质转化(EMT)和Wnt/β-catenin信号通路探讨其可能的分子机制。方法采用SD大鼠制备山仙颗粒低、中、高剂量含药血清和空白血清。体外培养Hepa1-6肝癌细胞,设空白血清组、KYA1797K组及山仙颗粒低、中、高剂量含药血清组。取各组干预12 h、24 h、36 h后的Hepa1-6肝癌细胞,通过划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-catenin和磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)蛋白表达情况。结果与空白血清组比较,山仙颗粒中、高含药血清组及KYA1797K组干预12 h后的细胞迁移距离和山仙颗粒各组及KYA1797K组干预24 h、36 h后的细胞迁移距离均明显缩短(P均<0.05);山仙颗粒各组及KYA1797K组干预12 h、24 h、36 h后的穿膜细胞数量均明显减少(P均<0.05),细胞中E-cadherin蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中N-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-GSK3β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。山仙颗粒低、中、高剂量含药血清组各时间点的细胞迁移距离呈剂量依赖性缩短,穿膜细胞数量呈剂量依赖性减少,细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量呈剂量依赖性升高或降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论山仙颗粒可以剂量依赖性地抑制Hepa1-6肝癌细胞的迁移和侵袭,其机制可能与调控Wnt/β-catenin通路,上调E-cadherin和下调N-cadherin、Vimentin的表达,从而抑制细胞EMT进程有关。

姜黄素对葡萄膜黑色素瘤细胞恶性生物学行为及Wnt/β-catenin通路的抑制作用

目的探究姜黄素对葡萄膜黑色素瘤(UM)恶性生物学行为的抑制作用及机制。方法应用含不同浓度(0、20、40和80μmol/L)姜黄素培养液培养M23细胞48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态学改变;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率;分别采用平板克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell实验检测M23细胞集落形成、凋亡、迁移及侵袭情况;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt/β-catenin通路相关基因c-Myc、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Survivin及基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA相对表达情况;采用Western blot法检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白c-Myc、Cyclin D1、Survivin、MMP-9、β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)及轴抑制蛋白2(Axin2)蛋白相对表达量。另取20只6周龄雌性BALB/c小鼠,左后腹皮下脂肪垫注射M23细胞悬浮液建立小鼠M23体内移植肿瘤模型,将造模成功小鼠按照随机数字表法随机平均分为模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,每组5只,分别腹腔内注射0、10、20和40 mg/kg姜黄素生理盐水溶液,连续注射30 d后剥离皮下瘤体并称质量。结果0μmol/L姜黄素组、20μmol/L姜黄素组、40μmol/L姜黄素组和80μmol/L姜黄素组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(83.78±4.59)%、(66.09±3.92)%和(47.16±3.63)%,细胞集落形成数分别为128.67±9.18、100.33±8.73、58.67±6.55和31.67±4.92,细胞凋亡率分别为(1.33±0.29)%、(14.53±2.04)%、(27.23±3.56)%和(44.73±4.36)%,细胞迁移率分别为(89.76±4.57)%、(65.43±3.70)%、(34.83±2.19)%和(18.82±1.99)%,细胞侵袭数分别为148.33±8.18、125.33±7.41、73.67±6.34、45.67±5.31,各组M23细胞存活率、集落形成数、细胞凋亡率、细胞迁移率、细胞侵袭数总体比较差异均有统计学意义(F=125.321、97.941、72.516、277.097、139.006,均P<0.001)。随姜黄素作用浓度的增大,细胞存活率、集落形成数、细胞迁移率、细胞侵袭数均明显降低,细胞凋亡率均明显增加,组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。随姜黄素浓度的增大,细胞中c-Myc、Cyclin D1、Survivin和MMP-9 mRNA和蛋白及β-catenin和p-GSK-3β蛋白相对表达水平均明显降低,Axin2蛋白相对表达水平明显升高,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。小鼠荷瘤质量随姜黄素作用剂量的增加而降低,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论姜黄素可抑制UM细胞M23增生、迁移、侵袭等恶性生物学行为,抑制肿瘤生长,促进细胞凋亡,其作用机制可能与阻断Wnt/β-catenin通路激活有关。