铝对PC12细胞淀粉样前体蛋白β位点裂解酶-1蛋白及基因表达的影响

[目的]探讨铝对PC12细胞淀粉样前体蛋白(APP)β位点裂解酶-1(beta-site amyloid precursor proteincleaving enzyme-1,BACE1)蛋白及基因表达的影响。[方法]采用PC12细胞进行培养及麦芽酚铝[Al(mal)3]染毒,将细胞分为6组,分别为:200μmol/L生理盐水组;0、50、100、200和400μmol/L Al(mal)3组。分别采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、荧光实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chainreaction,qRT-PCR)于染毒12、24和48 h后测定BACE1蛋白含量及基因表达。[结果]细胞计数试剂盒-8(CCK-8)细胞活力测定结果显示,不同浓度Al(mal)3染毒PC12细胞,可使其细胞活力呈现随染毒时间延长而逐渐下降的趋势。qRT-PCR结果显示,100μmol/L Al(mal)3组在染毒48 h后BACE1基因表达明显高于生理盐水组、0μmol/L Al(mal)3组,差异有统计学意义(P<0.05);200、400μmol/L Al(mal)3组染毒12、24、48 h后BACE1基因表达明显高于生理盐水组和0μmol/L Al(mal)3组,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA测定结果显示,染毒12 h后400μmol/L Al(mal)3组BACE1表达量明显高于生理盐水组和0μmol/L Al(mal)3组,差异均有统计学意义(P<0.05);染毒24 h后200、400μmol/L Al(mal)3组BACE1表达量明显高于生理盐水组和0μmol/L Al(mal)3组,差异有统计学意义(P<0.05);染毒48h后400μmol/L Al(mal)3组的BACE1表达量明显高于生理盐水组和0μmol/L Al(mal)3组,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]Al(mal)3对PC12细胞具有明显毒性作用,该作用可能与麦芽酚铝致PC12细胞BACE1蛋白和基因表达增强有关。

稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立

目的对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACE1基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性。方法提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691^+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性。结果成功扩增到758bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001)。结论成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体。