衰老相关β-半乳糖苷酶在老年大鼠肾脏组织中的变化及意义

【目的】研究大鼠肾脏组织随增龄衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性的变化规律，并探讨其与肾脏衰老的关系，以寻找可用于评判肾脏衰老的相关指标。【方法】留取3，12，24月龄Wistar大鼠肾脏（每组各6只）。采用PAS和Masson染色观察肾组织病理变化；β-gal染色观察大鼠肾组织SA-β-Gal活性的变化。【结果】随增龄，老年大鼠肾组织出现肾小球肥大，节段性肾小球硬化，局灶性肾小管萎缩、间质纤维化和炎性细胞浸润；肾脏病理评分显示肾小球和小管间质病变评分随增龄逐渐增高，24月龄组评分值显著高于3月龄和12月龄组（P〈0．05）。大鼠肾组织SA-β-gal染色阳性面积百分比随增龄逐渐升高，24月龄组阳性百分比显著高于3月和12月龄组（P〈0．05），并与同月龄组肾脏病理评分（肾小球和肾小管间质）呈正相关（r=0．585和0．612，P〈0．05）。【结论】随增龄大鼠肾组织SA-β-Gal表达逐渐增强，可能作为大鼠肾脏衰老的一项检测指标。

正常人成纤维细胞体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化(英文)

背景:二倍体成纤维细胞常用于研究细胞水平的衰老,β-半乳糖苷酶是鉴别衰老细胞的标志酶,本实验拟观察正常人成纤维细胞在体外培养过程中β-半乳糖苷酶的变化情况。目的:建立一个稳定的二倍体成纤维细胞体外培养体系,了解正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的变化规律。设计:自身对照实验。单位:潍坊医学院整形外科研究所、潍坊医学院附属医院普外科。材料:实验于2000-09/2002-09在潍坊医学院整形外科研究所完成。实验样本来源于在潍坊医学院附属医院普外科行包皮环切术的6～8岁正常男性儿童(n=20)切除的健康包皮组织。方法:①成纤维细胞培养:取包皮组织,分离真皮和表皮,真皮部分用含100mL/L胎牛血清DMEM培养液终止胰蛋白酶作用,再用200U/mLⅠ型胶原酶37℃条件下消化30min,收集细胞悬液,接种于培养皿中,细胞培养达80%汇合时进行传代培养。②细胞鉴定:用相差显微镜观察细胞形态变化及生长增殖情况、透射电镜及抗vimentin免疫细胞化学染色。③细胞生物学行为的观察对比:取生长状态良好的细胞,按群体倍增水平分为两组,第一组代表年轻细胞,采用10代龄;第二组代表老化细胞,采用65代龄。进行消化传代,分别按2×104,4×104分别接种于24孔培养板内。每隔24h消化计数,每次每组计数3孔,计算均值。共记数8d,以培养时间为横轴,细胞数为纵轴,绘制生长曲线并计算细胞的群体倍增时间。④β-半乳糖苷酶组化检测及阳性细胞的半定量分析:成纤维细胞每5n代龄(共13代)作细胞爬片,漂洗,加入SA-β-gal染色液,37℃孵育48h。在显微镜下观察计数,蓝染细胞为阳性细胞,每次随机挑选视野计数500个细胞,得到阳性细胞百分率。主要观察指标:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达。结果:①正常人成纤维细胞生物学行为的改变:细胞生长曲线显示,老化细胞生长速度较年轻细胞明显减慢。年轻细胞最大增殖数约为47.3×105,对数生长期在3.0～6.0d,细胞倍增时间为2.18d。老化细胞最大增殖数各为8.5×104,对数生长期分别在4.0～7.5d,细胞群体倍增时间依次为3.86d。②正常人成纤维细胞老化过程中β-半乳糖苷酶的表达:与年轻细胞组(阳性细胞率=4%)相比,衰老细胞组中阳性细胞率(60%)大为增强。直线相关分析结果显示,β-半乳糖苷酶染色的阳性率和细胞代龄之间呈显著正相关(r=0.92,P<0.01)。结论:在正常人成纤维细胞从年轻向老化发展的过程中,细胞群体倍增时间呈增高的趋势;与年轻细胞相比较(占4%),β-半乳糖苷酶的表达在老化细胞中显著增强(占60%),且这种增强与细胞衰老表型的出现和细胞增殖能力的丧失相平行,可反应细胞的老化程度。本实验为建立成纤维细胞衰老模型提供了实验依据,同时也为老年学及肿瘤生物学甚至组织工程学发展提供科学依据。

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体的构建与蛋白特性分析

目的构建嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因表达载体并分析其表达蛋白的特性和结构。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因并构建表达载体pMG36e-lacZ,并对构建后的表达载体进行鉴定和表达蛋白进行二维与三维结构分析。结果成功构建了嗜酸乳杆菌ATCC4356-lacZ基因表达载体并分析出了表达的β-半乳糖苷酶二维和三维结构图。结论表达载体的构建和蛋白特性与结构分析结果为后续的蛋白表达和酶生物学特性研究奠定了基础。

丁苯酞拮抗依托泊苷诱导的血管内皮细胞衰老

目的 探讨丁苯酞(3-n-butylphthalide, NBP)对依托泊苷诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)衰老的影响。方法 将HUVEC分为空白对照组(内皮细胞培养液)、依托泊苷组(500 nmol/L依托泊苷+二甲基亚砜)、依托泊苷+NBP低浓度组(500 nmol/L依托泊苷+5μmol/L NBP)、依托泊苷+NBP中浓度组(500 nmol/L依托泊苷+10μmol/L NBP)、依托泊苷+NBP高浓度组(500 nmol/L依托泊苷+20μmol/L NBP)组。通过衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色检测衰老细胞比例变化;实时荧光定量聚合酶链反应检测衰老相关分泌表型,如白细胞介素(IL)-8、IL-1β、CXC趋化因子配体1(CXCL1)mRNA水平变化;蛋白质免疫印迹检测衰老相关蛋白P21表达水平变化;免疫荧光染色检测增殖相关蛋白Ki67阳性细胞比例变化。结果 与空白对照组比较,依托泊苷组P21表达、SA-β-gal染色阳性细胞比例、IL-8、IL-1β、CXCL1的mRNA水平均显著升高[1.00±0.00 vs 0.59±0.09、(29.58±4.51)%vs(11.27±1.18)%、2.49±0.11 vs 1.00±0.03、6.32±0.15 vs 1.00±0.03、2.40±0.24 vs 1.00±0.04,P<0.05],Ki67阳性细胞比例显著降低[(5.95±1.55)%vs(27.38±7.00)%,P<0.05];与依托泊苷组比较,依托泊苷+NBP低浓度组的SA-β-gal染色阳性细胞比例、P21蛋白表达水平、IL-1β的mRNA水平均降低(P<0.05),Ki67阳性细胞比例增加(P<0.05)。结论 NBP对依托泊苷诱导的血管内皮细胞衰老具有拮抗作用。

广东青少年乳糖酶缺乏状况研究

目的 研究广东省青少年乳糖酶缺乏和乳糖不耐受的发生状况。方法 采用不同剂量乳糖进行氢呼气试验。按广东省地理分布 ,选择广州、珠海、佛山、韶关等 4个城市的 7～ 1 8岁健康中小学生 1 1 0 0名 ,摄入 2 5g乳糖后氢呼气试验阳性 (乳糖酶缺乏 )的 81 1人中 ,随机选取乳糖酶缺乏的青少年进行牛奶氢呼气试验。结果 随着乳糖摄入量的减少 (2 5g、1 2 .5g、6 .2 5g) ,乳糖酶缺乏的检出率均大幅度下降 ,分别为 73 .7%、1 9.7%、7.2 % ;乳糖不耐受的检出率亦有随着乳糖摄入量的减少而降低的趋势 ,检出率分别为 32 .9%、4 .3 %、2 .1 %。结论 广东省青少年乳糖耐受量为 6 .2 5g ,每次饮用奶 1 2 5ml,92 .8%的饮用者可以消化吸收 。

产乳糖酶酵母K luyveromyces fragilis株培养产酶发酵条件的优化

目的 :为进一步提高产乳糖酶酵母 Kluyveromyces fragilis(K.fragilis)株的酶产量 ,对该菌株的培养产酶发酵条件进行优化试验。方法 :采用增殖和诱导二步培养法培养酵母 K.fragilis株 ,并采用单因素试验方法分析碳源、氮源对酵母诱导产酶的影响。结果 :确定了 K .fragilis酵母株诱导培养的较佳配方 ,当乳糖浓度为 1 2 0 g/ L,醋酸铵浓度为 5 g/ L,p H为 6 .7时 ,单位酶产量达1 2 2 .4IU/ ml培养液。结论 :该菌株生长产酶情况良好 。

二苯乙烯苷可抑制中波紫外线诱导的人皮肤成纤维细胞光老化

目的:研究二苯乙烯苷(TSG)对紫外线B(UVB)诱导的人皮肤成纤维细胞(HSF)应激性提早衰老的作用及可能的机制。方法:UVB小剂量、多次照射HSF,每次照射完毕后分别用0.02、0.10、0.50 mmol/L浓度的TSG处理。实验分为6组:空白对照组、模型对照组、UVB+0.02 mmol/L TSG组、UVB+0.10 mmol/L TSG组、UVB+0.50 mmol/L TSG组、TSG对照组。采用细胞计数法(CCK-8)检测细胞增殖活性;细胞化学染色法检测衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)表达;TBA法、WST-1法测定细胞丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性;ELISA法测定细胞上清液中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的含量变化。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞增殖活性减弱(P<0.05),SA-β-gal染色呈强阳性,细胞裂解液中SOD活性减弱、MDA含量增加,MMP-1浓度升高(P<0.05或P<0.01)。与模型对照组比较,UVB+各浓度TSG组细胞增殖活性改善(均P<0.05),SA-β-gal染色阳性率下降,细胞裂解液中SOD活性增强、MDA含量减少,MMP-1浓度减小(P<0.05或P<0.01)。结论:TSG可以在一定程度上抑制UVB诱导的HSF应激性提早衰老,该作用可能与改善氧化应激、抑制MMP-1高表达有关。

不同浓度葡萄糖诱导皮肤成纤维细胞老化的实验观察

背景衰老是生理或病理过程综合作用的必然结果。研究如何延缓衰老,尤其是病理性衰老,可为许多疾病的治疗提供新的思路。而建立老化细胞模型正是衰老相关研究的基石。目的探究含不同浓度葡萄糖的DMEM培养液诱导皮肤成纤维细胞老化的效果,为衰老研究提供实验基础。方法分别采用含5.5 mmol/L、15 mmol/L、25 mmol/L、35 mmol/L和45 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养成纤维细胞,通过CCK-8实验和细胞划痕试验观察细胞增殖、迁移功能的变化;对细胞进行β-半乳糖苷酶染色,判断细胞是否发生衰老;采用PCR检测衰老相关p53/p21通路中关键效应分子p53、p21和p16在不同组中的表达水平。结果相较于5.5 mmol/L组,15 mmol/L组和25 mmol/L组成纤维细胞增殖和迁移功能提高,而35 mmol/L组和45 mmol/L组细胞增殖和迁移能力显著下降;β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞比例随葡萄糖浓度的升高而增加;同时,p53、p21和p16的表达与葡萄糖浓度呈正相关。结论高浓度葡萄糖(≥35 mmol/L)可抑制细胞的生物学功能,诱导细胞衰老,其分子机制可能是通过上调p53/p21通路引起p16表达水平的增高。

叉头框蛋白O3通过调控Nod样受体蛋白3炎性小体抑制心脏成纤维细胞衰老

目的 研究叉头框蛋白O3(FoxO3)在心脏成纤维细胞(CF)衰老中的作用及机制。方法 选取新生Wistar乳鼠第五代CF随机分为小干扰RNA转染对照(siNC)组和siFoxO3组(n=3)。siFoxO3组转染FoxO3小干扰RNA。通过实时定量PCR和免疫印迹法检测衰老和Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体相关基因以及FoxO3表达情况。结果 与原代CF比较,第五代CF中细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂2A(p16)和细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂1A(p21)mRNA表达、p21和平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)蛋白表达明显升高(P<0.05)。第五代CF中FoxO3 mRNA和蛋白表达明显低于原代(0.67±0.10 vs 1.03±0.02,0.47±0.12 vs 0.95±0.05,P<0.05)。与siNC组比较,siFoxO3组细胞中FoxO3 mRNA表达明显降低,而p16和p21 mRNA表达、p21蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01)。与siNC组比较,siFoxO3组细胞中NLRP3、硫氧还蛋白结合蛋白、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1、白细胞介素1βmRNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论 FoxO3通过调控NLRP3炎性小体抑制CF衰老,为衰老相关心血管疾病提供靶点。

中性粒细胞/淋巴细胞比值与2型糖尿病患者肾小管损伤的相关性研究

目的探讨中性粒细胞/淋巴细胞比值(NLR)与2型糖尿病(T2DM)患者肾小管损伤的关系。方法选取T2DM患者258例,测定中性粒细胞、淋巴细胞绝对值,计算NLR;采用免疫透射比浊法测定24 h尿微量白蛋白(24 h UMA);测定肾小管标志物β2-微球蛋白(β2-MG)、β-半乳糖苷酶(GAL)、视黄醇结合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG),以上4种标志物均正常者视为肾小管功能正常,任意1种或以上标志物超过上限视为肾小管功能受损。根据肾小管功能是否受损将患者分为正常组142例,受损组116例,比较2组间NLR水平差异。根据存在任意1种、2种、3种肾小管标志物异常将肾小管功能受损组进行分组,比较各亚组间NLR水平差异。另外,分析NLR与β2-MG、GAL、RBP、NAG的相关性。采用二分类Logistic回归分析T2DM患者肾小管损伤的影响因素。结果受损组NLR水平高于正常组(P<0.05)。随着肾小管标志物异常种类增多、肾小管损伤程度加重,NLR水平逐渐升高(P<0.05)。NLR与β2-MG、GAL、RBP、24 h UMA具有正相关性(r分别为0.191、0.152、0.131及0.158,P<0.05)。Logistic回归分析结果显示,较高水平NLR、24 h UMA是T2DM患者肾小管损伤的危险因素,而较高水平的HDL-C为其保护因素。结论NLR与T2DM患者肾小管损伤关系密切,可以反映肾小管损伤程度。

Galectin-3与肺腺癌淋巴及胸膜转移的关系

目的探讨β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)表达与肺腺癌淋巴及胸膜转移的关系。方法采用鼠抗人Galectin-3单克隆抗体和免疫组化链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法,检测63例肺原发性腺癌和34例胸膜转移性腺癌(均来自肺,影像学显示为非直接侵袭病灶)中Galectin-3的表达。结果发现Galectin-3同时存在于胞浆及胞核,未见单独的胞核表达。肺原发性腺癌胞浆、胞核表达阳性率分别为92.1%、31.7%,胞核表达与淋巴结转移(P=0.03)、临床分期有关(P<0.05)。胸膜转移性腺癌胞浆、胞核阳性率分别为97.1%、85.3%,胞核表达明显高于肺原发性腺癌,差异有统计学意义(P<0.05)。结论细胞核内Galectin-3可能增强肺腺癌细胞侵袭转移潜能,可作为判断淋巴结转移和/或胸膜转移的生物学指标。

Galectin-3与宫颈组织癌变关系的Meta分析

目的系统评价半乳糖凝集素-3(Galectin-3)与宫颈组织癌变的关系。方法通过“Galectin-3、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌”等关键词检索CBMdisc、CNKI、万方、维普、Pubmed、Web of science、Medline七个数据库,检索时间自建库至2020年7月。然后,两位研究人员按照纳入和排除标准独立进行文献的筛选,并提取资料。在对各个研究进行质量评价后,使用Stata12.0软件对纳入的研究进行分析。结果纳入17篇文献,共2262例受试者,包括正常宫颈组织293例、CIN 802例、宫颈癌1167例。Galectin-3表达阳性率的OR值(95%CI)为:宫颈癌组和正常宫颈组13.54(9.14,20.06)、宫颈癌组与CIN组3.86(2.65,5.61)、CIN组和正常宫颈组3.06(1.50,6.22)。结论Galectin-3表达上调会促进正常宫颈组织向宫颈癌的发展,检测Galectin-3的表达有助于评估宫颈癌的预后评估。

GM1神经节苷脂贮积症一例临床特点及GLB1基因突变分析

目的探讨GM1神经节苷脂贮积症的临床表现及β-半乳糖苷酶基因(GLB1)突变特点。方法回顾分析1例2018年3月于郑州大学附属儿童医院神经内科就诊的,经酶学及基因检测诊断的GM1神经节苷脂贮积症患儿的临床资料,并复习相关文献。结果男性患儿,4岁1个月,主要临床表现为精神运动发育倒退;β-半乳糖苷酶活力低(8.0 nmol·g^-1·min^-1)。目标序列捕获和二代测序检测发现患儿GLB1基因内含子区域存在两处杂合突变:c.458-2A(IVS4)>G和c.1068+5G(IVS10)>A,均为剪切位点突变;Sanger测序验证结果显示c.1068+5G(IVS10)>A突变来源于患儿母亲,c.458-2A(IVS4)>G为新发变异,患儿该基因为复合杂合突变。结论GM1神经节苷脂贮积症是一种罕见的神经退行性疾病,酶活性检测及基因检测有助明确诊断。

氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中β-连环蛋白的表达研究

目的 观察β-连环蛋白在氧化应激所致的人皮肤成纤维细胞衰老中的变化,探讨其在应激诱导的皮肤衰老中可能的作用.方法 从儿童包皮分离培养原代成纤维细胞,H2O2：处理第2～4代人皮肤成纤维细胞,显微镜观察其形态学改变,β-半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒检测β-半乳糖苷酶活性,RT-PCR、Western印迹检测β连环蛋白mRNA和蛋白表达水平.结果 150 μmol/L H2O2：处理2 h后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老.在应激诱导的衰老（SIPS）细胞中β-半乳糖苷酶阳性率达到（37.67±1.53）%.而对照细胞中只有（2.97±0.25）%,两组差异有统计学意义（P〈0.01）.RT-PCR 结果显示,在对照细胞组β连环蛋白/GAPDH mRNA比值为0.59±0.04,SIPS细胞组为0.29±0.30,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义（t=10.06,P〈0.01）.Western印迹结果显示,对照细胞组β连环蛋白/GAPDH蛋白比值为0.62±0.03,SIPS细胞组为0.31±0.01,对照细胞组明显高于SIPS细胞组,两组差异有统计学意义（t=14.97,P〈0.0）.结论 150 μmol/L H2O2：处理2 h可以诱导人皮肤成纤维细胞发生衰老改变,SIPS细胞中β连环蛋白表达水平明显降低,初步推测β连环蛋白可能是调控皮肤衰老的重要靶基因.

重组腺病毒介导LacZ基因在大鼠肺脏的表达

目的探讨重组腺病毒介导的β-半乳糖苷酶（LacZ）基因在大鼠肺脏的转基因表达。方法Wistar大鼠70只，随机分为Ad—Null组和Ad-LacZ组（n=35），分别应用1．67×10^9pfu/ml复制缺陷型重组腺病毒AdCMV和AdCMVLacZ各600μl，经气管导管滴入；各组于滴入病毒后2、5、7、14、21、28和35d行肺组织X-gal染色。另取大鼠20只，随机分为C组、L组、M组和H组（n=5），分别应用病毒保存液和低滴度（1．67×10^8pfu／ml）、中滴度（1．67×10^9pfu／ml）、高滴度（5×10^9pfu／ml）的AdCMVLacZ各600μl，滴入病毒后7d行肺组织X-gal染色和HE染色。结果滴入病毒后2d，Ad-LacZ组肺组织内即有转基因表达，滴入后7d达高峰，并维持至35d；转基因表达位于气管、支气管上皮细胞和肺泡细胞。H组、M组转基因阳性细胞率明显高于L组和C组（P〈0．01）。HE染色显示，H组中3只大鼠肺组织有轻度炎性浸润。所有动物均未见远隔器官转基因表达。结论气管内滴入重组腺病毒可呈剂量依赖性介导LacZ基因在大鼠肺内表达，但过高剂量可诱发机体炎性反应。

黏多糖贮积症ⅣB型一例临床特点及GLB1基因突变分析

目的报道1例中国人黏多糖贮积症（MPS）ⅣB型的临床特点、酶学分析、基因突变分析。方法对1例身材矮小、多发性骨骼畸形、运动障碍的14岁男性患儿进行白细胞MPSIV型相关的半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶和β-半乳糖苷酶（GLB1）的酶活性测定；采用PCR-直接测序方法，对β-半乳糖苷酶基因GLBl进行突变分析。结果患儿主要表现为矮小、鸡胸、脊柱后凸，智能发育正常，无抽搐、语言能力倒退等神经系统异常；患儿半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶活性正常，GLBl酶活性5．03nmol／（h·mg）[正常范围118～413nmol／（h·mg）]。患儿携带GLBl基因复合杂合突变c．442C〉T（p．R148C）／c．1454A〉G（p．Y485C），p．Y485C为未报道过的基因新变异。结论MPSIVB型患儿表现为严重的多发性骨骼畸形，智力正常且无神经系统损害症状；GLB1酶活性极低；携带2个杂合错义突变p．R148C／p．Y485C，GLB1基因新变异p．Y485C可能为MPSⅣB新型的致病突变。

限制能量摄入对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响

目的探讨限制能量摄入对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响。方法18月龄SD大鼠经过限制能量摄入（给予正常饮食量的60%）6个月,建立限制能量摄入动物模型。取限制能量摄入组（实验组）及对照组胰腺,行β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色并检测胰岛内p16的表达,以了解胰岛细胞衰老状态；同时检测胰岛B细胞胰岛素的表达。结果实验组与对照组比较。胰岛内p16表达减少,分别为（0.19130±0.02852）个和（0.24526±0.03191）个,差异有统计学意义（P〈 0.01）；胰岛内β-Gal染色阳性率分别为84%和100%（P〈0.01）、着色面积1.672和2.118（P〈 0.05）、着色程度1.725和2.412（P〈0.05）；胰岛素表达增加（201.7±35.3和187.8±26.0）,差异有统计学意义（P〈0.05）结论限制能量摄入可延缓胰岛B细胞衰老,改善胰岛的分泌功能。